» »

Визначення чутливості бактерій до антибіотиків. Метод серійних розведень. Джерела поширення резистентних штамів бактерій


Деякі збудники інфекційних захворювань з часом відкриття антибіотиків мало змінили характер первісної чутливості до цих препаратів (стрептококи групи А, пневмококи, менінгококи, бруцели, деякі сальмонели).

Разом з тим, більшість патогенних мікробів згодом набула стійкість до широко, часом неконтрольовано і необгрунтовано застосовуються протимікробних засобів. Найбільше значення проблема стійкості мікроорганізмів має відносно стафілококів, шигел, ешерихій, протея, серед яких антибіотикостійкість штами виділяються з найбільшою частотою.

Методи розведення бульйону і дискової дифузії є найбільш часто використовуваними методами бактеріальної культури і тестування чутливості до антибіотиків у ветеринарії. Обидва методи можуть бути використані для ідентифікації ймовірного патогена, який бере участь в бактеріальної інфекції, і антибіотика, найбільш ймовірно ингибирующего бактерії.

Еймс: прес-реліз Державного університету штату Айова. Мета: антимікробну довідкове керівництво по ефективному лікуванню. 2-е изд. Робіть і не робіть антимікробну терапію. Хазен, доктор філософії, професор патології і директор клінічної мікробіології, система охорони здоров'я Університету Дьюка.

За ступенем чутливості до основних антибіотиків мікроби поділяються на чутливі, помірно чутливі і стійкі. До групи чутливих входить більшість штамів мікроорганізмів, зростання яких на поживних середовищах припиняється при використанні концентрацій, відповідних середнім терапевтичним дозам антибіотиків. Якщо він пригнічується при застосуванні тільки максимальних доз препаратів, то такі мікроорганізми помірно чутливі до антибіотика. Якщо придушення зростання досягається в досвіді в лабораторії лише при дуже високих концентраціях препарату, які не можна створити в організмі, то такі збудники інфекції відносяться до стійких до антибіотика.

Тести чутливості визначають сприйнятливість інфекційного агента до протимікробних препаратів шляхом впливу стандартизованих концентрацій патогенів на конкретні концентрації протимікробних агентів. Тести на чутливість можуть проводитися на бактеріях, грибах і віруси. Для деяких організмів результати випробувань можуть передаватися від одного антибіотика до іншого, тому не всі потенційно корисні речовини перевіряються.

З цих причин результати тестів чутливості не завжди дозволяють зробити висновок про терапевтичному успіху. Тести чутливості можуть виконуватися якісно, ​​напівкількісної або з використанням молекулярно-біологічних методів. Ефект комбінацій антибіотиків можна визначити шляхом синергічного тестування.

Для визначення чутливості мікробів до антибіотиків існує ряд методів: метод послідовних розведень в рідкому поживному середовищі або живильному агарі, метод дифузії в агар (метод дисків, насичених антибіотиками) і прискорені методи. Метод дисків простий, широко використовується, але дає лише якісну відповідь. Більш надійним і точним кількісним методом є метод послідовних розведень антибіотиків в живильному середовищі в стандартних умовах досвіду. У більшості випадків кореляція даних лабораторних досліджень з клінічними буває досить повної, а терапія - ефективної при вивченні в динаміці не тільки клінічного перебігу процесу, а й можливої ​​зміни збудника або його чутливості до антибіотиків.

Якісні методи не так точні, як напівкількісні. Результати зазвичай даються як одну з таких дій. Деякі штами, які не мають критеріїв опору, можуть бути вказані тільки як сприйнятливі або несприйнятливі. Широко використовується метод дифузії агару може бути використаний для швидко зростаючих мікроорганізмів. Тут просочені антибіотиком тромбоцити поміщають на агарове середовище, інокулював досліджуваним патогеном. Після інкубації вимірюють діаметр зони гальмування навколо кожного тромбоцита.

Можна також визначити мінімальну бактерицидну концентрацію, але це технічно вимогливі і інтерпретаційні стандарти ще не узгоджені. Антибіотик можна розчинити в агарі або бульйоні, які потім інокуліруют патогеном. Метод розведення бульйону - золотий стандарт, але трудомісткий, тому що можна перевірити тільки одну концентрацію антибіотика на пробірку. Більш ефективний метод використовує поліефірную смугу, просочену градієнтом концентрації по всій його довжині.

Концентрація антибіотиків у тканинах і рідинах організму, як і їх антимікробну активність, відносяться до основних параметрів, що визначають ефективність антибіотикотерапії. При її вивченні найбільш широко застосовують мікробіологічні методи дослідження, засновані на здатності антибіотика затримувати зростання тест-мікроба.

Ці методи включають методи молекулярної біології, аналогічні методам ідентифікації патогенів, але модифіковані для виявлення відомих резистентних генів або мутацій. Крім того, оскільки нові мутації або інші гени стійкості можуть бути присутніми, їх відсутність не гарантує сприйнятливість до антибіотиків. З цих причин і тому, що ці тести чисельно обмежені, дорогі і не широко доступні, методи нуклеїнової кислоти не змогли замінити звичайні культури і тестування на чутливість.

Антібіограмми - спеціальна процедура обстеження в контексті так званої медичної мікробіології - є лабораторним тестом для визначення чутливості або стійкості мікробних патогенів до антибіотиків, препарат слід проводити перед кожною антибактеріальною терапією.

Для визначення чутливості бактерій до антибіотиків (антибіотикограми) зазвичай застосовують:

Метод дифузії в агар . На щільних живильне середовище засівають досліджуваний мікроб, а потім вносять антибіотики. Зазвичай препарати вносять або в спеціальні лунки в агарі, або на поверхні посіву розкладають диски з антибіотиками ( «метод дисків»). Облік результатів проводять через добу за наявністю або відсутністю зростання мікробів навколо лунок (дисків).

Антібіограмми з різними методами

Після бактеріальної культури створюється антібіограмми. В рамках культури бактерії розмножуються культивуванням, тоді різні класи антибіотиків перевіряються на ефективність проти відповідних бактерій. Для створення антібіограмми існують різні методи, наприклад.

Для нововведених антибіотиків рекомендації по оцінці виробників речовин також використовуються, якщо є достатні опубліковані дані, і їх підготовка була визначена і використана з використанням відповідних методів. Антібіограмми зазвичай починається з зразка, взятого у пацієнта за допомогою культури крові і мазка. Після наступної інкубації і зростання колоній в лабораторії, так зване пляма Грама і мікроскопічна морфологічна класифікація в коки і курчатах дають перший огляд. Разом з певними деталями пацієнта - такими, як вік, яка інфекція присутня, як лікувалася і т.д. Зазвичай можна розглядати як певний патоген до остаточної ідентифікації.

Метод дисків - якісний і дозволяє оцінити, чутливий або стійкий мікроб до препарату.

Методи визначення мінімальних інгібуючих і бактерицидних концентрацій, т. Е. Мінімального рівня антибіотика, який дозволяє in vitro запобігти видимий зростання мікробів в живильному середовищі або повністю її стерилізує. Це кількісні методи, які дозволяють розрахувати дозу препарату, так як концентрація антибіотика в крові повинна бути значно вище мінімальної інгібуючої концентрації для збудника інфекції. Введення адекватних доз препарату необхідно для ефективного лікування та профілактики формування стійких мікробів.

Крім відповідального патогена, друга цікава інформація полягає в тому, який антибіотик діє проти виявленого інфекційного зародка або чи існує резистентність. Однак цей так званий тест на дифузну ліфтів досі недостатньо стандартизований щодо граничних значень і активних речовин, які підлягають тестуванню для конкретного зародка. Часто не досліджують, які інші антибіотики можна прирівняти до дії випробуваного антибіотика для справжнього зародка.

Але це важливо декількома способами. Відмінності в ціні з еквівалентним, але не перевіреним антибіотиком або тестованими, не вказані в списку чи ні на складі, альтернативи вже є. Проблема з отриманням антібіограмми полягає в тому, що тест на інгібування антибіотика триває від 2 до 3 днів. Цей період повинен бути перекритий до початку цілеспрямованої терапії на основі антибіотиків. Однак через збільшення опору важливо критично переглянути кожне застосування антибіотиків.

Є прискорені способи, із застосуванням автоматичних аналізаторів.

Визначення чутливості бактерій до антибіотиків методом дисків.Досліджувану бактеріальну культуру засівають газоном на поживний агар або середовище АГВ в чашці Петрі.

Середа АГВ: сухий поживний рибний бульйон, агар-агар, натрій фосфат двозаміщений. Середовище готують з сухого порошку відповідно до інструкції.

Дослідження чутливості антибіотиків до патогенів є основним завданням мікробіологічної діагностичної лабораторії. Мета полягає в тому, щоб визначити якомога точніше, що дає інформацію про те, які антибіотики, ймовірно, будуть успішними в терапії.

Вибір перевірених антибіотиків буде адаптований до речовин, що використовуються більшістю клієнтів. Ми відмовляємося від вказівки торгових марок. Їх можна знайти в «Швейцарському медичному збірнику». Також в розділах 6 і 3. Вихідним матеріалом для випробувань на опір є чисті культури патогенів, виділених із зразків пацієнтів або відправлених зовнішніми лабораторіями. Два методу в основному використовуються для визначення антібіотікочувствітельності збудника.

На засіяну поверхню пінцетом поміщають на однаковій відстані одна від одної паперові диски, що містять певні дози різних антибіотиків. Посіви інкубують при 37 ° С до наступного дня. По діаметру зон затримки росту досліджуваної культури бактерій судять про її чутливості до антибіотиків.

Для отримання достовірних результатів необхідно застосовувати стандартні диски і поживні середовища, для контролю яких використовуються еталонні штами відповідних мікроорганізмів. Метод дисків не дає надійних даних при визначенні чутливості мікроорганізмів до погано дифундують в агар поліпептидним антибіотиків (наприклад, поліміксин, ристомицин). Якщо ці антибіотики передбачається використовувати для лікування, рекомендується визначати чутливість мікроорганізмів методом серійних розведень.

Метод дифузії диска. Антібіотікосодержащіе листочки поміщають на пластину агару, яку попередньо інокуліруют тестованим бактеріальним штамом. Антибіотик дифундує радіально в агар, утворюючи кільцевої градієнт концентрації. Під час інкубації бактерії ростуть разом в «дерен», а кругові зони утворюють навколо антибіотичних лусочок відповідно до чутливістю до антибіотиків. Переваги методу дифузії диска - його гнучкість у виборі антибіотиків, а також можливість отримати додаткову додаткову інформацію на додаток до зон пригнічення.

Визначення чутливості бактерій до антибіотиків методом серійних розведень.Даним методом визначають мінімальну концентрацію антибіотика, ингибирующую зростання досліджуваної культури бактерій. Спочатку готують основний розчин, що містить певну концентрацію антибіотика (мкг / мл або ОД / мл) в спеціальному розчиннику або буферному розчині. З нього готують всі наступні розведення в бульйоні (в обсязі 1 мл), після чого до кожного розведення додають 0,1 мл досліджуваної бактеріальної суспензії, що містить 10 6 -10 7 бактеріальних клітин в 1 мл. В останню пробірку вносять 1 мл бульйону і 0,1 мл суспензії бактерій (контроль культури). Посіви інкубують при 37 ° С до наступного дня, після чого зазначають результати досвіду по помутніння живильного середовища, порівнюючи з контролем культури. Остання пробірка з прозорою живильним середовищем вказує на затримку росту досліджуваної культури бактерій, під впливом міститься в ній мінімальної інгібуючої концентрації (МІК) антибіотика.

Мінімальні інгібуючі концентрації. Мінімальна інгібуюча концентрація описує чутливість до антибіотиків в одиницях концентрації міліграмів антибіотика на літр. Це дозволяє пряме порівняння з досяжними концентраціями сироватки відповідного активної речовини. Мінімальна інгібуюча концентрація знаходиться в найнижчій концентрації антибіотика, при якій не може бути виявлений зростання патогенів.

Виняток становлять патогени, виділені з культур крові, які містяться в протягом трьох місяців. Інтерпретація тестів опору. Для класифікації зазвичай використовуються найостанніші рекомендації Європейського комітету з тестування на протимікробну сприйнятливість. Наприклад, використовуються речовини-маркери, які дуже чутливо виявляють механізми опору, які можуть привести до невдачі лікування.

Оцінку результатів визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків проводять за спеціальною готової таблиці, яка містить граничні значення діаметрів зон затримки росту для стійких, помірно стійких і чутливих штамів, а також значення МІК антибіотиків для стійких і чутливих штамів.

Крім того, результат тестування конкретного речовини зазвичай не обмежується самим собою, а поширюється на цілий клас антибіотиків, для яких досліджувана речовина було вибрано як представницьке. При інтерпретації даних необхідно враховувати, що результати можуть варіюватися в залежності від технічної та біологічної мінливості, наприклад. У разі тестування чутливості до антибіотиків одного і того ж штаму патогена з різних зразків пацієнтів ця мінливість може привести до відхиляють інтерпретаціям в антібіограмми.

До чутливих належать штами мікроорганізмів, зростання яких пригнічується при концентраціях препарату, виявляються в сироватці крові хворого при використанні звичайних доз антибіотиків. До помірно стійким відносяться штами, для пригнічення росту яких потрібні концентрації, що створюються в сироватці крові при введенні більш високих доз препарата.Устойчівимі є мікроорганізми, зростання яких не пригнічується препаратом в концентраціях, що створюються в організмі при використанні максимально допустимих доз.

Визначення спеціальних механізмів опору. Деякі механізми резистентності, особливо ті, які призводять до резистентності до кількох лікарських засобів, мають життєво важливе значення з точки зору гігієни лікарень. Ці механізми включають, для.

Наявність цих механізмів відзначається в лабораторних звітах і направляється в лікарню. Мал. 1: Принцип і приклад методу дискової дифузії. Малюнок 2: Принцип мінімальної інгібуючої концентрації.




Малюнок 3: Індукційний феномен в методі дифузії диска.

Визначення антибіотика в крові, сечі та інших рідинах організму людини.У штатив встановлюють два ряди пробірок. В одному з них готують розведення еталонного антибіотика, в іншому - досліджуваної рідини. Потім в кожну пробірку вносять суспензію тест-бактерій, приготовлену в середовищі Гисса з глюкозою. При визначенні в досліджуваній рідині пеніциліну, тетрацикліну, еритроміцину в якості тест-бактерій використовують стандартний штам S. aureus, а при визначенні стрептоміцину - Е. coli. Після інкубування посівів при 37 ° С протягом 18-20 год відзначають результати досвіду по помутніння середовища і її фарбування індикатором внаслідок розщеплення глюкози тест-бактеріями. Концентрація антибіотика визначається множенням найбільшого розведення досліджуваної рідини, що затримує ріст тест-бактерій, на мінімальну концентрацію еталонного антибіотика, що затримує ріст тих же тест-бактерій. Наприклад, якщо максимальне розведення досліджуваної рідини, що затримує ріст тест-бактерій, дорівнює 1: 1024, а мінімальна концентрація еталонного антибіотика, що затримує ріст тих же тест-бактерій, 0,313 мкг / мл, то твір 1024х0,313 = 320 мкг / мл становить концентрацію антибіотика в 1 мл.




Антибіотики відносяться до числа найбільш важливих розробок в медицині. Пеніцилін і багато наступних препарати викликають такі захворювання, як сифіліс, пневмонія, ранові інфекції, отруєння кров'ю або скарлатина. В результаті середня тривалість життя неухильно росте, і бактеріальні інфекції в даний час значно відстають від серцево-судинних захворювань і раку як причини смерті. Однак деякі з цих інфекцій знову стають проблемою здоров'я. Причина: збільшення стійкості до антибіотиків.

Визначення здатності S. aureus продукувати бета-лактамазу.У колбу з 0,5 мл добової бульонной культури стандартного штаму стафілокока, чутливого до пеніциліну, вносять 20 мл розплавленого і охолодженого до 45 ° С поживного агару, перемішують і виливають у чашку Петрі. Після застигання агару в центр чашки на поверхню середовища поміщають диск, що містить пеніцилін. За радіусів диска петлею засівають досліджувані культури. Посіви інкубують при 37 ° С до наступного дня, після чого зазначають результати досвіду. Про здатність досліджуваних бактерій продукувати бета-лактамазу судять за наявністю зростання стандартного штаму стафілокока навколо тієї чи іншої досліджуваної культури (навколо диска).

Занадто часте і неправильне використання

«Антибіотики відносяться до числа найбільш широко використовуваних препаратів для людей, тварин і сільського господарства», - пояснює Оскар Джаната. Додаток дійсно призначене тільки для дуже серйозних бактеріальних інфекцій. «Занадто недбале і неточне управління призвело до десятиліть до збільшення бактеріальних патогенів, які стали менш чутливими або навіть повністю стійкими до антибіотиків».

Крім того, антибіотики часто не приймаються належним чином. Біля кожного другого пацієнта припиняється лікування занадто рано, хоча патогени в повному обсязі усунені. Такі фактори, як занадто раннє припинення терапії, занадто низька дозування або занадто тривала тривалість терапії, в кінцевому рахунку, сприяють формуванню резистентності.



Для визначення чутливості мікробів до антибіотиків існує ряд методів, серед яких найбільш поширені: метод послідовних розведень в рідкому поживному середовищі або живильному агарі, метод дифузії в агар (метод дисків, насичених антибіотиками) і ряд прискорених методів.

Визначення чутливості мікробів до антибіотиків in vitro проводиться в умовах, що значно відрізняються від тих, в яких препарат діє в організмі. На його результати великий вплив роблять такі чинники, як склад і рН живильного середовища, величина посівної дози, вік культури, умови культивування та ін. При використанні методу дифузії в агар на результати досліджень впливають товщина шару живильного середовища, її вологість, швидкість дифузії антибіотиків, швидкість росту досліджуваних мікроорганізмів і ін. метод дифузії в агар (метод паперових дисків) найбільш простий і широко використовується, проте є лише якісним. Метод послідовних розведень антибіотика в живильному середовищі в стандартних умовах досвіду є більш надійним і точним кількісним методом.

Метод серійних розведень

Показанням до визначення чутливості методом серійних розведень є необхідність отримання кількісних даних (переважно при тяжкому перебігу процесів) для проведення регульованої антибіотикотерапії (розробка режимів введення).

Встановлення ступеня чутливості до ряду антибактеріальних препаратів мікроба, що викликає інфекційний процес, впливає на вибір антибіотика (відмова від препаратів, що характеризуються відносно високою токсичністю при помірній чутливості до них збудника), його дозування (концентрація антибіотика в крові в 2 - 3 рази повинна перевищувати його МПК щодо збудника) і режим введення. Кількісне визначення чутливості необхідно також для визначення бактерицидності обраного препарату (як гарантії швидкого терапевтичного ефекту і безрецидивного перебігу) щодо даного збудника.

Існують дві модифікації методу - визначення чутливого мікробів до антибіотиків на рідкої і на щільною поживних середовищах.

Метод дає можливість визначити мінімальну переважну зростання концентрацію антибіотика (МПК) для виділеного штаму збудника. Він полягає в приготуванні ряду послідовних розведень антибіотиків в живильному середовищі з внесенням до всіх розведення досліджуваної культури з придушення росту мікроба певною концентрацією антибіотика в живильному середовищі судять про ступінь чутливості мікроорганізму.

«Раціональна антибіотикотерапія»,
   С. М. Навашин, І.П.Фоміна

Невдачі антибіотикотерапії можуть бути обумовлені також неправильним вибором доз і методів введення препарату, пізнім початком лікування, застосуванням антибіотиків в занижених дозах при комбінованої терапії, недостатньою тривалістю лікування і т. Д. Не завжди береться також до уваги можливість інактивації антибіотиків ферментними системами організму, зв'язування білками крові і тканин, некротичними масами і ін. Незадовільні результати лікування при ...


До прискореним методам визначення чутливості відноситься метод, за допомогою якого виявляється освіту інволюційних форм бактерій під дією антибіотика при фазово-контрастної мікроскопії. Інволюційні форми мікроорганізмів утворюються в присутності бактериостатических концентрацій антибіотика. За відсутності його при дії суббактеріостатіческіх концентрацій, а також при стійкості досліджуваного штаму до препарату виростають нормальні мікроколонії. Морфологічні зміни досліджуваних культур під дією антибіотика ...


У разі чутливості до дії антибіотика штаму збудника не відбувається зброджування глюкози при культивуванні на середовищі, що містить глюкозу, феноловий червоний (як індикатор) і певні концентрації антибіотика. При цьому середовище забарвлюється в фіолетовий колір внаслідок її подщелачивания. Зміна червоного кольору середовища на жовтий свідчить про розщеплення глюкози з утворенням кислоти в результаті росту штаму, стійкого ...


В Англії до теперішнього часу застосовують запропонований Flemming метод канавки. Для визначення чутливості мікробів до антибіотиків цим методом в чашці з агаром вирізують смужку для отримання канавки, а потім засівають штрихом перпендикулярно до канавці випробовувані штами мікробів. Канавка заповнюється розтопленим і охолодженим до 35-60 ° С агаром, що містить певні концентрації антибіотика. Завдяки дифузії антибіотика в живильне середовище ...


Відсутність зони затримки росту мікроба навколо диска свідчить про те, що випробуваний штам нечутливий до даного антибіотика; при зоні діаметром до 10 мм штам розцінюється як малочутливий. Поодинокі колонії або тонка плівка зростання всередині зони затримки росту не враховуються. Розмір зон може змінюватися в залежності від товщини шару агару, густоти мікробного газону, складу середовища. Однак ...


Для скорочення обсягу випробування слід використовувати набори дисків з урахуванням виду виділеного збудника і локалізації інфекції (дивіться таблицю нижче). Основні набори дисків з антибіотиками, рекомендовані для визначення чутливості в залежності від виду виділеної культури і патологічного матеріалу Антибіотик, що міститься в диску Попереднє випробування чутливості мікрофлори патологічного матеріалу Випробування чутливості чистої культури гній сеча мокрота Staphylococcus ...


Для контролю точності і стандартності проведення досліджень в кожному досвіді необхідно використовувати тест-культури з відомою чутливістю до антибіотиків. ВООЗ рекомендує для цієї мети три культури Американської колекції типових культур: Escherichia coli (АТСС 25922), Staphylococcus aureus (АТСС 25923), Pseudomonas aeruginosa (АТСС 27853). При визначенні чутливості виділених збудників необхідно проводити контрольний аналіз з вимірюванням зон затримки росту ...


Приготування чашок Розплавлену щільних середу (бульйон на переварити Хоттингера з вмістом 120-140 мг% амінного азоту - 1000 мл; агар-агар «тафуінскій» -15 г, натрію фосфат двозаміщений - 3 г, рН після стерилізації 7,0-7,2 ) розливають по 20 мл у стерильні чашки Петрі діаметром 100 мм, розташовані на горизонтальній поверхні. Перед зараженням поверхню застиглої середовища підсушують протягом ...


З двох способів визначення чутливості мікробів до антибіотиків (в рідкій і щільному середовищі) більш точним є метод серій розведень в рідкому середовищі. Результати, отримані при визначенні чутливості в твердому живильному середовищі, менш постійні. Метод розведень в агарі не слід застосовувати для оцінки чутливості мікробів, що дають тонкий, розріджене зростання (стрептококи, пневмококи) або широко розповсюджуються по поверхні ...


Залежно від величини посівної дози значення МПК антибіотика може коливатися: при збільшенні дози чутливість знижується за рахунок зростання кількості утвореної стафілококами пеніцилінази в середовищі. Пробірки інкубують при 37 ° С протягом 18-24 год. Результати враховують, визначаючи наявність або відсутність зростання мікроба в середовищі, що містить різні розведення антибіотика. Остання пробірка з затримкою росту (прозорий бульйон) ...