Непрямої гемаглютинації. Реакції непрямої або пасивної гемаглютинації

Реакцію проводять для виявлення антигенів збудників в досліджуваному матеріалі, додаючи в нього імунну сироватку. При наявності гомологичного антигену відбувається зв'язування антитіл, тому після додавання сенсибілізованих антигеном еритроцитів їх аглютинації не відбувається, що оцінюється як позитивний результат. Для більшої чутливості реакції специфічну імунну сироватку додають до досліджуваного матеріалу в мінімальній кількості (2 гемагглютинирующие одиниці). Титр імунної сироватки визначають попередньо за допомогою РНГА. За одну гемагглютинирующих одиницю приймають граничне розведення сироватки, яке викликає склеювання еритроцитів.

Методика. В лунки полістиролових пластин або агглютінаціонние пробірки вносять по 0,025 мл 1% розчину нормальної сироватки кролика і роблять серійні 2-кратні розведення досліджуваного матеріалу. Потім в усі лунки додають по 0,025 мл імунної сироватки, пластинку струшують і залишають на 30 хв при температурі 37 ° С або на 1 ч при кімнатній температурі. Далі в усі лунки додають по 0,025 мл антигенного диагностикума, струшують і залишають на 2 год, після чого враховують результати.

При проведенні цієї реакції до контролю для РНГА додають контроль специфічності імунної сироватки, що складається із специфічного антигену, імунної сироватки (2, 1, 0,5 гемагглютинирующей одиниці) і суспензії сенсибілізованих еритроцитів.

РТНГА застосовують також для виявлення специфічних антитіл (повних і блокуючих), для чого до досліджуваної сироватці додають дозовану кількість антигену. Якщо в ній містяться антитіла, то відбувається зв'язування їх антигеном, тому після додавання еритроцитів, сенсибілізованих антитілами (2-й етап РТНГА), склеювання еритроцитів не відбувається.

Завдяки використанню мінімальної кількості антигену (2 нейтралізують дози) реакція високочутлива. Кількість нейтралізують доз в антигенному препараті визначають за допомогою РНГА, при цьому роблять серійні 2-кратні розведення антигену в 1% розчині нормальної сироватки кролика і в лунки вносять антитільний еритроцитарний діагностикум. Нейтралізує дозою антигену вважають його максимальне розведення, що дає повне склеювання сенсибілізованих еритроцитів.

Перед проведенням реакції досліджувані сироватки розводять 1: 5-1: 10 і інактивують при температурі 56 ° С протягом 30 хв. Для адсорбції гемагглютининов до сироваткам додають 50% суспензія формалінізірованних або свіжих відмитих еритроцитів барана з розрахунку 0,1 мл суспензії на 1 мл розведеної сироватки. Суміш струшують і інкубують 30 хв при температурі 37 ° С або 1 ч при кімнатній температурі, після чого еритроцити осаджують центрифугуванням. Можна для осадження еритроцитів залишити сироватки в холодильнику до наступного дня.

При проведенні досвіду досліджуваний матеріал розводять в 1% розчині нормальної сироватки кролика в обсязі 0,025 мл в лунках панелі мікротитратор. Потім в кожну лунку додають по 2 нейтралізують дози антигену в обсязі 0,025 мл. Пластини струшують і залишають на 30 хв при температурі 37 ° С або на 1 ч при кімнатній температурі. Потім в усі лунки вносять по 0,025 мл антитільної еритроцитарного диагностикума. Пластини струшують і інкубують 1,5-2 ч при кімнатній температурі, після чого враховують результати реакції. Облік можна проводити також і на наступний день. Титром досліджуваної сироватки вважають максимальне розведення її, в якому не відбувається склеювання еритроцитів.

Досвід супроводжують наступними видами контролю:

1) стабільності сенсибілізованих еритроцитів (еритроцити +1% розчин нормальної сироватки кролика);

2) повноти виснаження гемагглютининов в кожної випробуваної сироватці (випробувана сироватка в найменшому розведенні + формалінізірованних еритроцити);

3) правильності визначення мінімальної нейтралізує дози антигену (2, 1 і 0,5 нейтралізує дози антигену + антитільний еритроцитарний діагностикум).

Реакція зворотної непрямої гемаглютинації (ронго) застосовується для індикації бактеріальних і вірусних антигенів в досліджуваних матеріалах, а також для експрес-діагностики ряду інфекцій.

На відміну від РНГА при даній реакції еритроцити сенсибилизируют НЕ антигеном, а антитілами, аглютинація яких відбувається при додаванні антигену.

Еритроцити попередньо фіксують формаліном, або глютаральдегіду, а потім пов'язують їх з гамма-глобуліном, який виділяють з імунних сироваток і очищають від інших сироваткових білків. Зв'язування гамма-глобуліну з поверхнею еритроцитів відбувається за допомогою хлориду хрому. Для цього до 8 обсягами дистильованої води додають 1 обсяг імуноглобулінів, виділених з імунної сироватки, 1 обсяг 50% суспензії формалінізірованних еритроцитів і 1 об'єм 0,1-0,2% розчину хлориду хрому. Суміш залишають на 10-15 хв при кімнатній температурі, потім обробляють еритроцити як при реакції пасивної гемаглютинації.

Специфічність антительного диагностикума перевіряють в реакції гальмування пасивної гемагглютііаціі гомологічним антигеном. Реакція повинна гальмуватися гомологічним антигеном не менше ніж в 16 разів і не гальмуватися гетерологічним. Використовується контроль на відсутність спонтанної гемаглютинації.

За допомогою цієї реакції проводять індикацію збудників в матеріалі, взятому з органів загиблих людей і тварин, наприклад, з мозку, селезінки, печінки легких. Готують 10% суспензію зазначених органів на фізіологічному розчині натрію хлориду, центрифугують їх протягом 30-60 хв при 10000 об / хв і використовують надосадову рідину в якості антигену.

Методика.Готують 2-кратні розведення досліджуваного матеріалу (антигену) на стабилизирующем розчині. Вносять по 1 краплі кожного розведення антигену в 3 сусідні лунки мікропанелі (реакція займає 3 паралельних ряди лунок). У кожну лунку першого ряду додають по 1 краплі стабілізуючого розчину, в лунки другого ряду - по 1 краплі гомологичной імунної сироватки в розведенні 1: 10, третього ряду - по 1 краплі гетерологичной імунної сироватки. Другий і третій ряди служать контролями специфічності реакції. Суміш залишають на 20 хв при кімнатній температурі.

У всі лунки додають по 1 краплі 1% суспензії сенсибілізованих еритроцитів (еритроцитарний антитільний диагностикум) і ретельно струшують пластини. Результати реакції враховують через 30-40 хв. При наявності специфічного антигену гемагглютинация відзначається в першому і третьому ряду (з гетерологичной сироваткою) і відсутній у другому ряду, де антиген попередньо нейтралізований гомологичной сироваткою.

Реакцію супроводжують контролями сенсибілізованих еритроцитів на спонтанну аглютинацію.

Реакція гальмування зворотного непрямої гемаглютинації (РТОНГА)дозволяє визначити наявність антитіл в сироватках людей і тварин.

Методика. Сироватки розводять в 10 разів фізіологічним розчиномнатрію хлориду, прогрівають 20 хв при температурі 65 ° С для руйнування неспецифічних інгібіторів, а потім готують 2-кратні розведення сироваток на стабилизирующем розчині і робочу дозу антигену, що містить 4 агглютинирующие одиниці. Вносять по 1 краплі кожного розведення сироватки в лунки мікропанелі і додають в них по 1 краплі антигена, розведення якого відповідає робочій дозі. Після контакту компонентів суміші протягом 20 хв при кімнатній температурі в усі лунки вносять по 1 краплі еритроцитарного антительного диагностикума і ретельно струшують. Через 1,5-2 год інкубації при кімнатній температурі по гемаглютинації враховують результати реакції. Титром сироватки є її найбільше розведення, яке повністю гальмує реакцію гемаглютинації з чотирма аглютинативна одиницями антигену.

Реакцію супроводжують контролями сенсибілізованих еритроцитів на спонтанну аглютинацію в присутності: а) стабілізуючого розчину; б) нормального антигену (з матеріалу, що не містить вірус); в) досліджуваної сироватки. Перевага реакції полягає в її універсальності і можливості використання для виявлення різних антигенів.

Оцінка результатів гемаглютинації. Результати РНГА, ронг і РТОНГА враховують за ступенем аглютинації еритроцитів: (++++) - повна аглютинація; (+++) - менш повна аглютинація; (++) - часткова аглютинація; (+) - сліди аглютинації; (-) - відсутність аглютинації.

Реакція вважається позитивною, якщо аглютинація повна (++++) або майже повна (+++), діагностикумів не дає спонтанної аглютинації в присутності кожного компонента реакції і контроль специфічності антигену або антитіла позитивний.

Зміст теми "Імуномодулятори. Іммунодіагностіка інфекційних захворювань.":

Пасивні реакції аглютинації. Непрямі реакції аглютинації. Реакція непрямої, або пасивної, гемаглютинації (РНГА, РПГА). Зворотній РНГА. Реакція гальмування пасивної гемаглютинації (РТПГА).

ці реакціїназиваються непрямими (пасивними), Так як при їх проведенні використовують Аг (або AT), штучно сорбованих на поверхні різних корпускулярних частинок.

Реакція непрямої, або пасивної, гемаглютинації (РНГА, РПГА) - одна з найбільш чутливих серологічних реакцій. Заснована на здатності AT взаємодіяти з Аг, фіксованими на різних еритроцитах, які при цьому агглютинируют. Для більшої стабільності діагностикумів еритроцити формалінізіруют.

Зворотній РНГАзастосовується для виявлення Аг в сироватці крові; для цього на еритроцитах фіксує не Аг, a AT. Реакції цього типу широко застосовують для діагностики інфекційних хвороб, встановлення вагітності, виявлення підвищеної чутливості до ліків і т.д.

Реакція гальмування пасивної гемаглютинації (РТПГА) - подальший розвиток РНГА; в деякому сенсі контролює її специфічність. На відміну від РНГА, Складається із трьох компонентів; Аг, AT і Аг (AT), адсорбовані на еритроцитах. Спочатку Аг реагує з AT (стандартна антисироватка), потім в суміш вносять еритроцити, сенсибілізовані аналогічним Аг (або AT). Якщо при взаємодії Аг з AT в системі не залишаються вільні AT (або Аг), то аглютинації еритроцитарного диагностикума не спостерігають.

Головна → Аналізи → Імунологічний метод → Реакції гемаглютинації (імунологічний метод)

реакції аглютинаціїзасновані на взаємодії реагенту (антитіл) з антигенами, що знаходяться на поверхні клітин або сторонніх часток. В результаті утворюються агрегати великого розміру, які випадають в осад і їх можна побачити навіть неозброєним оком. Таким чином визначають групу крові за системою АВО, наявність в ній резус-фактора і ін. Це більш чутливий порівняно з реакціями преципитации спосіб діагностики, так як обсяг осаду (агглютіната) перевершує обсяг преципитата.

пряма гемагглютинация

Реакція прямої гемаглютинації (РПГА) використовується для виявлення поверхневих антигенів мікроорганізмів і еритроцитів, а також антитіл до них.
До стандартних сироваток, що містять антитіла, додають досліджуваний матеріал (кров). Швидкість прямої реакції аглютинації пов'язана з кількістю досліджуваного матеріалу, кількістю і концентрацією сироватки, температурою навколишнього середовища.

непряма гемагглютинация

Реакцію непрямої гемаглютинації проводять для виявлення антитіл в крові пацієнта за допомогою еритроцитарного диагностикума. Реагент є еритроцити, на поверхні яких розташований антиген (білки мікроорганізмів, токсинів, алергенів і ін.).
Сироватку крові пацієнта розводять 0,9% -ним розчином натрію хлориду, потім додають еритроцитарний діагностикум і відстежують результат. Цей високочутливий спосіб діагностики виявляє антигени навіть в невеликих концентраціях.

Реакція гемаглютинації (РГА).

У лабораторії користуються двома різними за механізмом дії реакціями гемаглютинації.

Перша РДА відноситься до серологічним. У цій реакції еритроцити агглютинируются при взаємодії з відповідними антитілами (гемаглютиніни). Реакцію широко використовують для визначення груп крові.

Друга РДА не є серологічної. У ній склеювання еритроцитів викликають не

антитіла, а особливі речовини, що утворюються вірусами. Наприклад, вірус грипу агглютинирует еритроцити курей і морських свинок, вірус поліомієліту - еритроцити барана. Ця реакція дозволяє судити про наявність того чи іншого вірусу в досліджуваному матеріалі.

Реакцію проводять в пробірках або на спеціальних пластинках з лунками. Досліджуваний на наявність вірусу матеріал розводять фізіологічним розчином від 1:10 до 1: 1280; 0,5 мл кожного розведення змішують з рівним об'ємом 1-2% суспензії еритроцитів. В контролі 0,5 мл еритроцитів змішують з 0,5 мл ізотонічного розчину. Пробірки ставлять на 30 хвилин у термостат, а пластини залишають при кімнатній температурі на 45 хвилин.

Облік результатів.При позитивному результаті реакції на дні пробірки або лунки випадає осад еритроцитів з фестончастими краями ( «парасольку»), що покриває все дно лунки. При негативному результаті еритроцити утворюють щільний осад з рівними краями ( «гудзик»). Такий же осад повинен бути в контролі. Інтенсивність реакції виражають знаками «+».

реакція гемаглютинації

Титром вірусу є максимальне розведення матеріалу, в якому відбувається аглютинація.

Реакція гальмування гемаглютинації

Це серологічна реакція, в якій специфічні противірусні антитіла, взаємодіючи з вірусом (антигеном), нейтралізують його і позбавляють здатності агглютинировать еритроцити, т. Е. Гальмують реакцію гемаглютинації. Ця реакція дозволяє визначити вид і тип вірусів.

Постановка реакції. 0,25 мл противірусної сироватки змішують з рівним об'ємом матеріалу, що містить вірус. Суміш струшують і поміщають в термостат на 30 хвилин, після чого додають по 0,5 мл'1-2% суспензії еритроцитів.

Облік результатів.При правильній постановці досвіду в контролі сироватки і еритроцитів повинна утворитися «гудзик» - немає агглютинируют еритроцити фактора; в контролі антигену утворюється «парасольку» - вірус викликав агглютинацию еритроцитів. Якщо сироватка гомологична досліджуваному вірусу, утворюється «гудзик» - сироватка нейтралізувала вірус.

Реакція непрямої гемаглютинації

Реакція непрямої (пасивної) гемаглютинації (РИГА) заснована на тому, що еритроцити, якщо на їх поверхні адсорбувати розчинний антиген, набувають здатність агглютинироваться при взаємодії з антитілами до адсорбувати антигену.

Постановка реакції.Сироватку прогрівають 30 хвилин при 56 ° С, розводять послідовно в співвідношенні 1:10 - 1: 1280 і розливають по 0,25 мл в пробірки або лунки, куди потім додають по 2 краплі еритроцитів з адсорбованими на них антигенами.

контролі:суспензія еритроцитів з адсорбованими на них антигенами зі свідомо імунною сироваткою, суспензія еритроцитів з адсорбованими на них антигенами з нормальною сироваткою; суспензія нормальних еритроцитів з випробуваної сироваткою. У першому контролі повинна відбутися аглютинація, у другому і третьому її не повинно бути.

Контрольні питання.

1. Про що свідчить позитивний результат РДА між еритроцитами і досліджуваним на наявність вірусу матеріалом?

2. Чи відбудеться реакція аглютинації еритроцитів, якщо до них додати вірус і відповідну йому сироватку? Як називається реакція, що виявляє цей феномен?

ПРАКТИЧНА РОБОТА №12.

Реакція зв'язування комплементу.

Реакція зв'язування компліменту (РСК) заснована на тому, що 'специфічний комплекс антиген - антитіло завжди адсорбує на собі (пов'язує) комплемент.

Цю реакцію широко застосовують при ідентифікації антигенів верб серодіагностики інфекцій, особливо захворювань, викликаних спірохетами (реакція Вассермана), рикетсіями і вірусами.

РКС-складна серологічна реакція. У ній беруть участь комплемент і дві системи антиген-антитіло. По суті, це дві серологічні реакції.

Права система-основна складається з антигену і антитіла (один відомий, ін. Немає). До неї додають певну кількість комплементу. За відповідності антигену і антитіла цієї системи вони з'єднаються і зв'яжуть комплімент. Утворився комплекс дрібнодисперсний і не видно.

Про освіту цього комплексу дізнаються за допомогою другої системи гемолітичної або індикаторної. У неї входять еритроцити барана (антиген) і відповідне їм гемолітична сироватка (антитіло), тобто готовий імунний комплекс. У цій системі лізис еритроцитів може статися тільки в присутності комплементу. Якщо комплемент пов'язаний першою системою, то в другій системі гемолізу НЕ буде-тому немає вільного комплементу. Відсутність гемолізу (вміст пробірки каламутне або на дні її осад еритроцитів) реєструють як позитивний результат РСК.

Якщо в першій системі антиген не відповідає антитілу, то імунний комплекс не утворюється і комплімент залишиться вільним. Що залишився вільним, комплімент бере участь у другій системі, викликаючи гемоліз, результат РСК негативний (вміст пробірок прозоро "лакова кров").

Компоненти, реакції зв'язування комплементу:

1. Антиген - зазвичай лизат, екстракт, гаптен,

рідше суспензія мікроорганізмів.

2. Антитіло - сироватка хворого.

3. Комплемент - сироватка морських свинок.

4. Антиген - еритроцити барана.

5. Антитело - гемолізин до еритроцитів барана.

6. Изотонический розчин.

З огляду на те, що в РСК бере участь велика кількість складних компонентів,

вони повинні бути попередньо відтитровані і взяті в реакцію в точних кількостях і в рівних обсягах: по 0,5 або 0,25, рідше по 0,2,1,25 або 1,0 мл (великі обсяги дають більш точний результат). Титрування компонентів реакції проводять в тому ж обсязі, в якому ставлять досвід, замінюючи відсутні інгредієнти фізіологічним розчином.

Схожа інформація:

Пошук на сайті:

Реакція непрямої або пасивної гемаглютинації (РНГА або РПГА) більш чутлива і специфічна, ніж реакція аглютинації. Цю реакцію також використовують в двох напрямках.

1) Для виявлення антитіл в сироватці крові хворого примі-ються еритроцитарні діагностикуми, в яких антиген адсорб-ваний на поверхні оброблених таніном еритроцитів. У ставлення-ванні цієї реакції частіше вживають термін РПГА.

Досліджувану сироватку розводять в лунках пластмасових план-шетов і додають еритроцитарний діагностикум. При позитивними-ної реакції з'являється тонка плівка по стінках лунки у вигляді "кру-Жевнов парасольки», при негативній реакції - щільний осад еритему-РОЦИТ у вигляді "гудзики".

2) Для виявлення токсинів і бактеріальних антигенів в дослід-ледуемом матеріалі застосовують антитільної еритроцитарні діагнос-тікуми, отримані шляхом адсорбції антитіл на еритроцитах. У від-носінні цієї реакції частіше вживається термін РНГА. Наприклад, за допомогою антитільних діагностикумів виявляють антиген па-лочки чуми, дифтерійний екзотоксин, ботулінічний екзотоксин.

Що таке еритроцитарний діагностикум? Що таке антитільний еритроцитарний діагностикум?

Еритроцитарні діагностикуми є еритроцити (оброблені таніном або формаліном) з адсорбованими на них антигенами, витягнутими з бактерій, і застосовуються в РПГА (реакції пасивної гемаглютинації). У тому випадку, коли РПГА використовується для виявлення антигену в виділеннях хворих, в тканинах і ін., Застосовують «антитільної діагностикуми», т. Е. Еритроцити, сенсибілізовані антитілами.

У РНГА виявляють антитіла сироватки крові за допомогою антигенного еритроцитарного диагностикума, який представляє собою еритроцити з адсорбованими на них антигенами.

Методика постановки реакцій. Реакція коагглютинации.

- фіксація еритроцитів формальдегідом або глютарового, або акриловим альдегидами. Такі оброблені еритроцити тривало зберігаються. Найчастіше для цієї мети використовують еритроцити барана, людини, курей та ін .;
- обробка фіксованих еритроцитів розчином таніну. В результаті еритроцити набувають властивість незворотньо адсорбувати на своїй поверхні білки (віруси і антитіла);
- сенсибілізація танізірованних еритроцитів вірусами або антитілами.

Реакція коагглютинации (РКА)

Реакцію коагглютинации застосовують для визначення антигенів за допомогою антитіл, адсорбованих на білку А клітин стафілокока (антитільний диагностикум).
Білок А має спорідненість до Fc-фрагменту імуноглобулінів, тому такі бактерії, оброблені імунної діагностичної сироваткою неспецифически адсорбируют антитіла сироватки, які потім взаємодіють активними центрами з відповідними мікробами, виділеними від хворих. В результаті коагглютинации утворюються пластівці, що складаються з стафілококів, антитіл діагностичної сироватки і визначається мікроба.

Агглютинирующие сироватки: що вони містять; як їх отримують, для чого застосовуються; що таке титр агглютинируют сироватки?

Агглютинируют сироватку отримують імунізацією кролів (внутрішньовенно, підшкірно або внутрішньочеревно) суспензією убитих бактерій, починаючи з дози 200 млн., Потім 500 млн., 1 млрд., 2 млрд., Мікробних тіл в 1 мл, з інтервалами 5 днів. Через 7-8 днів після останньої імунізації беруть кров і визначають титр антитіл.

Титром агглютинируют сироватки називається то максимальне розведення сироватки, при якому відбувається аглютинація з відповідним мікроорганізмом.

Агглютинирующие сироватки застосовуються при ідентифікації мікроба в розгорнутій реакції аглютинації.

Реакція гемаглютинації (РГА)

Якщо досліджуваний мікроорганізм аглютинується сироваткою до титру або до половини значення титру, його можна вважати належним до того виду, назва якого зазначено на етикетці ампули.

У чому відмінності між полівалентними і моновалентною (монорецепторними) аглютинативна сироватками; чому при імунізації кролика бактеріями одного виду виходить сироватка, яка містить антитіла до декількох антигенів?

Імонорецепторние сироватки - сироватки, що містять антитіла толь-ко до одного антигену, і полівалентні сироватки, що дають реакції аг-глютінаціі з двома-трьома спорідненими бактеріями, мають про-щий антиген. Агглютинирующие сироватки застосовують для ідентифікації мікроорганізмів в реакції аглютинації. Недоліком таких сироваток є те, що вони спо-собнимі давати групові реакції аглютинації, тому що вони містять ан-ника до бактерій, що має спільні антигени.

Реакція гемаглютинації. Опис і застосування

Заснована на тому, що еритроцити, на яких попередньо адсорбовані антигени, набувають здатність агглютинироваться в присутності гомологічних сироваток (антитіл).

Еритроцити при цьому виконують роль носіїв зі специфічними детермінантами, аглютинація яких відбувається в результаті реакції антиген + антитіло.

Еритроцити, до поверхні яких міцно приєднані антигени, називають еритроцитарних антигенних діагностикумів, або еритроцитами, сенсибілізованими антигеном.

Інший тип РНГА - на поверхні еритроцитів адсорбовані антитіла і подальша їх аглютинація відбувається в присутності гомологичного антигену. У цьому випадку такі еритроцити називають еритроцитарних антитільним діагностикумів, або еритроцитами, сенсибілізованими антитілами.

На основі цих двох принципових методичних підходів розроблені і використовуються багато модифікації РНГА. Так, в якості носіїв застосовують дрібні стандартні частинки латексу. В цьому випадку реакцію називають реакція латекс аглютинації (РЛА) або використовують золотистий стафілокок - реакція коагглютинации і т. Д. Зазвичай еритроцитарні діагностикуми готують на підприємствах біологічної промисловості, а в діагностичних лабораторіях ставлять вже головний досвідРНГА.

Приготування еритроцитарних діагностикумів включає наступні етапи:

• фіксація еритроцитів формальдегідом або глютарового, або акриловим альдегидами. Такі оброблені еритроцити тривало зберігаються. Найчастіше для цієї мети використовують еритроцити барана, людини, курей та ін .;
• обробка фіксованих еритроцитів розчином таніну. В результаті еритроцити набувають властивість незворотньо адсорбувати на своїй поверхні білки (віруси і антитіла);
• сенсибілізація танізірованних еритроцитів вірусами або антитілами.

Необхідно відзначити, що методи приготування еритроцитарних діагностикумів для вірусних інфекційрізна.

Методика постановки РНГА для виявлення і визначення титру антитіл полягає в наступному:

• до послідовним 2-кратним розведенням сироватки додають рівні дози еритроцитів, сенсибілізованих антигеном;
• суміш залишають на 2-3 год при кімнатній температурі або на 16-18 год при 4 ° С;
• враховують результати. Якщо в сироватці містяться антитіла до вірусу, яким були сенсибілізовані еритроцити, спостерігають гемаглютинацію, яку оцінюють в хрестах.

За титр антитіл в сироватці приймають найвище розведення сироватки, яке ще забезпечує гемаглютинацію не менше ніж на два хрести.

РНГА супроводжується всіма відповідними контролями. Зазвичай ставлять реакцію мікрометодом.

РНГА дозволяє вирішувати наступні діагностичні завдання:

• виявити антитіла і визначити їх титр у сироватці крові за допомогою відомого еритроцитарного антигенного диагностикума;
• виявити і ідентифікувати невідомий вірус за допомогою відомого еритроцитарного антительного диагностикума.

Переваги РНГА: висока чутливість, простота техніки постановки і швидкість відповіді. Однак важливо відзначити, що виникають великі труднощі в приготуванні стабільних еритроцитарних діагностикумів (велика залежність від чистоти використовуваних компонентів, необхідність підбору режиму фіксації, танізаціі і сенсибілізації еритроцитів для кожного виду вірусу).

Якщо ви знайшли помилку, будь ласка, виділіть фрагмент тексту і натисніть Ctrl + Enter.

Реакція ставиться:

1) для виявлення полісахаридів, білків, екстрактів бактерій та інших високодісперстних речовин, рикетсій і вірусів, комплекси яких з агглютининами в звичайних РА побачити не вдається,

2) для виявлення антитіл в сироватках хворих до цих високодісперстним речовин і найдрібніших мікроорганізмів.

Під непрямий, або пасивної, агглютинацией розуміють реакцію, в якій антитілавзаємодіють з антигенами, попередньо адсорбованими на інертних частинках (латекс, целюлоза, полистерол, оксид барію і ін. Або еритроцити барана, I (0) -групи крові людини)

В реакції пасивної гемаглютинації (РПГА) в якості носія використовують еритроцити. Навантажені антигеном еритроцити склеюються в присутності специфічних антитіл до даного антигену і випадають в осад. Сенсибілізовані антигеном еритроцити використовують в РПГА як еритроцитарний діагностикум для виявлення антитіл (серодиагностика). Якщо навантажити еритроцити антитілами (еритроцитарний антитільний диагностикум), то можна застосовувати для виявлення антигенів.

Мал. 3. Схема РПГА: еритроцити (1), навантажені антигеном (3), зв'язуються специфічними антитілами (4).

постановка. У лунках полістиролових планшетів готують ряд послідовних розведень сироватки. У передостанню лунку вносять - 0,5 мл свідомо позитивної сироватки і в останню 0,5 мл фізіологічного розчину (контролі). Потім в усі лунки додають по 0,1 мл розведеного еритроцитарного диагностикума, струшують і поміщають в термостат на 2 ч.

облік. У позитивному випадку еритроцити осідають на дні лунки у вигляді рівного шару клітин зі складчастим або зазубреним краєм (перевернутий парасольку), в негативному - осідають у вигляді гудзики або колечка.

Рис.4. Облік РНГА (РПГА).

Облік результатів РНГА, поставленої з метою виявлення ботулотоксину.

Збудник ботулізму - Clostridium botulinum виробляє токсини семи сероварів (А, B, C, D, E, F, G), однак частіше за інших зустрічаються серовар А, В, Е. Всі токсини відрізняються за антигенними властивостями і можуть бути диференційовані в реакціях типоспецифічними сироватками . Для цієї мети можна поставити реакцію пасивної (непрямий) гемаглютинації з сироваткою хворого, в якій передбачається наявність токсину, і еритроцитами, навантаженими антитілами антитоксических Протиботулінічні сироваток типів А, В, Е. Контролем служить нормальна сироватка.

Мал. 3. Постановка і результат РНГА.

Облік. У позитивному випадку еритроцити осідають на дні лунки у вигляді рівного шару клітин зі складчастим або зазубреним краєм (перевернутий парасольку), в негативному - осідають у вигляді гудзики або колечка.

Висновок: У сироватці хворого виявлено ботулотоксин тип Е.

Реакція гальмування гемаглютинації (РГГА).

Мал. 8. Реакція гальмування гемаглютинації (РГГА) (схема).

Принцип реакції заснований на здатності АТ пов'язувати різні віруси і нейтралізувати їх, позбавляючи можливості агглютинировать еритроцити. Візуально цей ефект і проявляється в «гальмуванні» гемаглютинації. РГГА застосовують при діагностиці вірусних інфекцій для виявлення специфічних антигемагглютининов та ідентифікації різних вірусів по їх гемаглютиніну, котрі виявляють властивості Аг.

Типування вірусу проводять в реакції РГГА з набором типоспецифічних сироваток. Результати реакції враховують по відсутності гемаглютинації. Підтипи вірусу типу А з антигенами H0N1, H1N1, H2N2, H3N2 і інші можуть бути диференційовані в РГГА з набором гомологічних типоспецифічних сироваток

Мал. 9. Результати РГГА при типування вірусу грипу

Умовні позначення: - гальмування гемаглютинації (гудзик); - гемагглютинация (парасолька).

Висновки: Досліджуваний матеріал містить вірус грипу тип А з антигеном H3N2

Реакція прямої аглютинації мікробів (РА). У цій реакції антитіла (аглютиніни) безпосередньо агглютинируют корпускулярні антигени (агглютаногени). Зазвичай вони представлені суспензією інактивованих мікроорганізмів (реакція мікробної аглютинації). За характером утворюється агглютіната розрізняють зернисту і пластівчасту агглютинацию. Зерниста аглютинація відбувається при склеюванні мікробів, що містять О-антиген. Бактерії, що мають джгутики (Н-антиген), агглютинируются з утворенням великих пластівців.

Для визначення виду мікроорганізмів використовують стандартні діагностичні агглютинирующие сироватки. Їх отримують гипериммунизации лабораторних тварин суспензією бактерій. Титром такої сироватки є її найбільше розведення, при якому спостерігається виразна аглютинація відповідного антигену. Однак через складність антигенної структури бактерій, агглютинирующие сироватки містять антитіла не тільки до видоспецифічні, але і до групових антигенів і можуть давати групову агглютинацию з родинними видами бактерій. Титри антитіл до видоспецифічні антигенів в сироватці завжди вище, ніж до групових. Для видалення группоспецифических антитіл в сироватку послідовно додають мікроорганізми, до складу яких входять групові антигени (метод Кастеллани). Таким методом отримують адсорбовані сироватки, які містять антитіла до певного виду мікроба.

Методи реакції аглютинації.Найбільш поширені пластинчатая (орієнтовна) і розгорнута РА.

Пластинчасту РА ставлять на склі. У цій реакції використовують сироватки з невеликим розведенням або нерозведені. Використовують її як прискорений метод виявлення антитіл або ідентифікації мікроорганізмів. На скло наносять краплю сироватки, в яку петлею вносять невідому культуру бактерій, перемішують і через 2-3 хвилини спостерігають появу дрібнозернистої або пухкі аглютинації. Для контролю використовують краплю фізіологічного розчину, в якій після внесення бактерій спостерігається помутніння. При використанні неадсорбованими сироваток реакція на склі має тільки орієнтовне значення.

Розгорнуту РА проводять в пробірках або лунках пластин. При цьому діагностичну сироватку розводять до титру і вносять однакові кількості антигену. При позитивному результаті на дні пробірки утворюється пухкий осад у вигляді "парасольки", при негативному - осад у вигляді "ґудзика". Оскільки титри группоспецифических антитіл в сироватці значно нижче, ніж титр видоспецифических, групові реакції спостерігаються лише в невеликих розведеннях сироватки. Якщо аглютинація відбувається до титру або до половини титру сироватки, вона є відоспеціфетеской.

Для визначення антитіл в сироватці хворого (серологічний діагноз) використовують стандартний мікробний диагностикум, що містить суспензію відомих мікробів або їх антигенів. У цьому випадку також можна ставити пластинчатую і розгорнуту РА.

Реакція прямої аглютинації клітин. Для визначення груп крові використовують стандартні сироватки крові донорів, які містять відомі анти-А або анти-В антитіла. Реакції ставлять на склі або пластинах. При наявності на еритроцитах А (2-я група крові), В (3-я група крові) або обох антигенів (4-я група крові) відповідні сироватки агглютинируют еритроцити. Застосовується також проба на сумісність крові, коли краплі крові донора і реципієнта змішують і оцінюють агглютинацию.

У клініках застосовують реакцію аглютинації лейкоцитів, тромбоцитів та інших клітин для виявлення аутоантитіл, а також для визначення антигенів на цих клітинах.

В основі реакції гемаглютинації лежить феномен склеювання еритроцитів, що відбувається під впливом різних факторів. Розрізняють пряму і непряму гемаглютинацію.
При реакції прямої гемаглютинації відбувається склеювання еритроцитів при адсорбції на них певних антигенів, наприклад вірусів.

Реакція непрямої (пасивної) гемаглютинації (РНГА, РПГА)заснована на використанні еритроцитів (або латексу) з адсорбованими на їх поверхні антигенами або антитілами, взаємодія яких з відповідними антитілами або антигенами сироватки крові хворих викликає склеювання і випадання еритроцитів на дно пробірки або осередки у вигляді фестончатого осаду.

Компоненти.Для постановки РНГА можуть бути використані еритроцити барана, коня, кролика, курки, миші, людини і інші, які заготовляють про запас, обробляючи формаліном або глютаральдегіду. Адсорбційна ємність еритроцитів збільшується при обробці їх розчинами таніну або хлориду хрому.

Антигенами в РНГА можуть служити полісахаридні АГ мікроорганізмів, екстракти бактеріальних вакцин, АГ вірусів і рикетсій, а також інші речовини.

Еритроцити, сенсибілізовані АГ, називаються еритроцитарних діагностикумами. Для приготування еритроцитарного диагностикума найчастіше використовують еритроцити барана, що володіють високою адсорбирующей активністю.

застосування. РНГА застосовують для діагностики інфекційних хвороб, визначення гонадотропного гормону в сечі при встановленні вагітності, для виявлення підвищеної чутливості до лікарських препаратів, Гормонів і в деяких інших випадках.

В серологічних дослідженнях застосовують реакцію гальмування прямий гемаглютинації, коли виділений у хворого вірус нейтралізують специфічної імунної сироваткою, а потім з'єднують з еритроцитами. Відсутність гемаглютинації говорить про відповідність вірусу і використовуваної імунної сироватки.

Реакція непрямої гемаглютинації (пасивна гемагглютинация) спостерігається в тих випадках, коли до еритроцитів, заздалегідь обробленим (сенсибілізованим) різними антигенами, додають імунну сироватку або сироватку хворого, що має відповідні антитіла. Відбувається специфічне Склеювання еритроцитів, їх пасивна гемагглютинация.

Реакція непрямої, або пасивної, гемаглютинації по чутливості і специфічності перевершує інші серологічні методи, і її використовують при діагностиці інфекцій, викликаних бактеріями, рикетсіями, найпростішими.

Методика постановки реакції непрямої гемаглютинації складається з декількох етапів.

· Спочатку еритроцити відмивають фізіологічним розчином хлориду натрію, потім при необхідності (при використанні антигенів білкової природи) їх обробляють розчином таніну 1: 20000 та сенсибилизируют розчинними антигенами.

· Після відмивання буферним фізіологічним розчином хлориду натрію еритроцитарний антиген готовий до вживання.

· Досліджувані сироватки розводять фізіологічним розчином хлориду натрію в пробірках або спеціальних пластмасових пластинках з луночками, потім до кожного розведення сироватки додають еритроцитарний діагностикум.

· Результати реакції непрямої гемаглютинації враховують за характером осаду еритроцитів, що утворився на дні пробірки.

· Позитивним вважають результат реакції, при якому еритроцити рівномірно покривають все дно пробірки. При негативній реакції еритроцити у вигляді маленького диска або «гудзика» розташовуються в центрі дна пробірки.

· Через 2 год інкубації при 37 ° С враховують результати, оцінюючи зовнішній виглядосаду еритроцитів (без струшування): при негативній реакції з'являється осад у вигляді компактного диска або кільця на дні лунки, при позитивній реакції - характерний мереживний осад еритроцитів, тонка плівка з нерівними краями

Реакція коагглютинации.

В основу цієї реакції належить унікальна властивість золотистого стафілокока, що має в складі своєї клітинної стінки білок А, зв'язуватися з Fc-фрагментами IgG і IgM.

При цьому активні центри антитіл залишаються вільними і можуть взаємодіяти зі специфічними детермінантами антигенів. На предметне скло наносять краплю 2% -ної суспензії стафілококів, сенсибілізованих відповідними антитілами, і додають краплю суспензії досліджуваних бактерій. За відповідності антигену антитіл через 30-60 с відбувається чітка аглютинація навантажених антитілами стафілококів.

Вимоги до імунної сироватці, використовуваної для сенсибілізації клітин стафілокока, і проведення процесу сенсибілізації. Для отримання коагглютинирующего реагенту суспензія стафілококів слід обробити імунною сироваткою проти шуканого антигену. Сироватка повинна бути взята від тваринного, IgG якого має спорідненості до білка А. Найбільшою спорідненістю до нього мають імуноглобуліни людини, свині, собаки і морської свинки, меншим - осла і кролика, a IgG вівці, коні, щури та миші взаємодіють з ним дуже слабо .

Крім суворої специфічності до шуканого антигену сироватка, яка використовується в РКОА, не повинна містити антитіл до стафілококу, щоб уникнути аглютинації стафилококкового реагенту, обумовленої специфічним впливом антигену і антитіл, яка в системі IgG - білок А повинна бути виключена. Контроль проводять шляхом змішування на склі однієї краплі сироватки і 10% -й суспензії стафилококкового реагенту. Якщо після закінчення 3 ... 5 хв не утворюються пластівці агглютіната, то сироватку вважають придатною для реакції.

Якщо наявні зразки сироваток до цього антигену агглютинируют стафілокок, то можна провести їх адсорбцію суспензією стафілококових клітин, які не мають білка А (наприклад, штами Wood-46). Таким шляхом видаляють антитіла, що реагують зі стафілококом за рахунок Fab-фрагментів.

Таким чином, сироватка, що застосовується для приготування коагглютинирующего реагенту, повинна відповідати таким вимогам:

• отримана від тварини-продуцента, IgG якого має спорідненості з білку А;
• повинна володіти специфічністю по відношенню до шуканого антигену;
• бути вільна від протівостафілококковий антитіл.

· приготування диагностикума. Приготований 10% -й стафілококовий реагент з'єднують з рівним об'ємом імунної сироватки в певному раніше оптимальному робочому розведенні. Суміш струшують протягом 60 хв при 40 ... 42 ° С в шутгель-апараті при 90 коливаннях в 1 хв. Потім через 15 хв двічі відмивають ФБР, ресуспензіруют до 2% -й суспензії і консервують мертіолат натрію (1: 10 000).