Головна » отит » Реакція непрямої гемаглютинації. Серологічні реакції: види, використання

Реакція непрямої гемаглютинації. Серологічні реакції: види, використання

Реакція непрямої гемаглютинації (РИГА).

РИГА застосовують в двох варіантах: з відомими АГ для виявлення АТ з відомими АТ для виявлення АГ. Ця реакція специфічна, і застосовують її для діагностики захворювань, викликаних бактеріями та риккетсиями. Для проведення РИГА використовують еритроцитарні діагностикуми, приготовані шляхом адсорбції на еритроцитах АГ або АТ - в залежності від мети дослідження (рис. 10.3). В позитивних випадках ступінь аглютинації еритроцитів відзначають плюсами. Чотирма плюсами оцінюють реакцію, що має вигляд тонкої плівки з склеюються еритроцитів (парасолька), що покриває дно пробірки; наявність плівки з фестончастими мереживними краями позначають двома плюсами. За титр приймають граничне розведення досліджуваного матеріалу, що викликало агглютинацию еритроцитів на два плюса.

Рис. 10.3.

1 - еритроцити, 2 - АГ еритроцита, 3 - кон'югований АГ, 4-АТ

РДА і реакція гальмування гемаглютинації (РГГА).

Як уже зазначалося, в основі РДА лежить здатність еритроцитів склеюватися при адсорбції на них певних АГ. В якості досліджуваного матеріалу при гемаглютинації використовують аллантоісную, амніотичну рідину, суспензію хоріон-аллантоісной оболонок курячих ембріонів, суспензії і екстракти з культур або органів тварин, заражених вірусами, нативний інфекційний матеріал. РДА не є серологічної реакцією, оскільки відбувається без участі імунної сироватки і використовується для вибору робочого розведення АГ для постановки РГГА або наявності АГ (вірусу) в досліджуваному матеріалі (наприклад, при грипі). В реакції використовуються еритроцити тварин, птахів, людини з I (0) групою крові. Для постановки орієнтовною РДА на предметне скло наносять краплю 5% -й суспензії еритроцитів і краплю випробуваного матеріалу, ретельно змішують. При позитивному результаті через 1-2 хв макроскопически спостерігають появу пластівчасту аглютинації еритроцитів. Для постановки РДА в розгорнутому ряду в лунках полістиролових планшетів готують дворазово зростаючі розведення досліджуваного матеріалу на фізіологічному розчині в обсязі 0,5 мл. У всі пробірки вносять по 0,5 мл 0,25-1% -й суспензії еритроцитів. Результати враховують після повного осідання еритроцитів у контролі (еритроцити + фізіологічний розчин). Реакцію враховують за характером осаду еритроцитів. В позитивних випадках ступінь аглютинації відзначають плюсами. Чотирма плюсами оцінюють реакцію, що має вигляд тонкої плівки з склеєних еритроцитів, що покриває дно пробірки (парасолька), реакцію з прорізами в плівці відзначають трьома плюсами, наявність плівки з фестончастими мереживними краями з склеєних еритроцитів позначають двома плюсами, пластівчастий осад еритроцитів, оточений зоною грудочок агглютінірованних еритроцитів, відповідає одному плюса. Різко окреслений осад еритроцитів, не відрізняється від контролю, показує відсутність аглютинації. За титр приймають граничне розведення досліджуваного матеріалу, що викликало агглютинацию еритроцитів на два плюса. При позитивному результаті РДА дослідження продовжують, визначаючи тип виділеного вірусу за допомогою РТ ГА типоспецифічними сироватками. РГГА заснована на властивості антисироватки пригнічувати вірусну гемаглютинацію, так як нейтралізований специфічними АТ вірус втрачає здатність агглютинировать еритроцити. При орієнтовному типування вірусів використовують крапельний метод на склі. Для остаточного встановлення типової приналежності виділеного вірусу і титрування АТ в сироватках ставлять розгорнуту РГГА в пробірках або в лунках. З цією метою готують дворазові розведення сироваток на фізіологічному розчині і розливають по 0,25 мл. До розведень сироватки додають по одній краплі матеріалу, що містить вірус, і по одній краплі 1% -й суспензії еритроцитів. При використанні РГГА для визначення типу вірусу використовують типоспецифічні сироватки, які додають до рівного об'єму робочого розведення АГ. Типову належність виділеного вірусу встановлюють за специфічною імунної сироватці, яка показала найвищий титр АТ до цього вірусу. РДА і РГГА широко застосовуються для діагностики вірусних інфекцій (кліщового енцефаліту, грипу та ін.) З метою виявлення специфічних АТ і для ідентифікації багатьох вірусів по їх АГ.

Головна → Аналізи → Імунологічний метод → Реакції гемаглютинації (імунологічний метод)

реакції аглютинації засновані на взаємодії реагенту (антитіл) з антигенами, що знаходяться на поверхні клітин або сторонніх часток. В результаті утворюються агрегати великого розміру, які випадають в осад і їх можна побачити навіть неозброєним оком. Таким чином визначають групу крові за системою АВО, наявність в ній резус-фактора і ін. Це більш чутливий порівняно з реакціями преципитации спосіб діагностики, так як обсяг осаду (агглютіната) перевершує обсяг преципитата.

пряма гемагглютинация

Реакція прямої гемаглютинації (РПГА) використовується для виявлення поверхневих антигенів мікроорганізмів і еритроцитів, а також антитіл до них.
До стандартних сироваток, що містять антитіла, додають досліджуваний матеріал (кров). Швидкість прямої реакції аглютинації пов'язана з кількістю досліджуваного матеріалу, кількістю і концентрацією сироватки, температурою навколишнього середовища.

непряма гемагглютинация

Реакцію непрямої гемаглютинації проводять для виявлення антитіл в крові пацієнта за допомогою еритроцитарного диагностикума. Реагент є еритроцити, на поверхні яких розташований антиген (білки мікроорганізмів, токсинів, алергенів і ін.).
Сироватку крові пацієнта розводять 0,9% -ним розчином натрію хлориду, потім додають еритроцитарний діагностикум і відстежують результат. Цей високочутливий спосіб діагностики виявляє антигени навіть в невеликих концентраціях.

Реакція гемаглютинації (РГА).

У лабораторії користуються двома різними за механізмом дії реакціями гемаглютинації.

Перша РДА відноситься до серологічним. У цій реакції еритроцити агглютинируются при взаємодії з відповідними антитілами (гемаглютиніни). Реакцію широко використовують для визначення груп крові.

Друга РДА не є серологічної. У ній склеювання еритроцитів викликають не

антитіла, а особливі речовини, що утворюються вірусами. Наприклад, вірус грипу агглютинирует еритроцити курей і морських свинок, вірус поліомієліту - еритроцити барана. Ця реакція дозволяє судити про наявність того чи іншого вірусу в досліджуваному матеріалі.

Реакцію проводять в пробірках або на спеціальних пластинках з лунками. Досліджуваний на наявність вірусу матеріал розводять фізіологічним розчином від 1:10 до 1: 1280; 0,5 мл кожного розведення змішують з рівним об'ємом 1-2% суспензії еритроцитів. В контролі 0,5 мл еритроцитів змішують з 0,5 мл ізотонічного розчину. Пробірки ставлять на 30 хвилин у термостат, а пластини залишають при кімнатній температурі на 45 хвилин.

Облік результатів.При позитивному результаті реакції на дні пробірки або лунки випадає осад еритроцитів з фестончастими краями ( «парасольку»), що покриває все дно лунки. При негативному результаті еритроцити утворюють щільний осад з рівними краями ( «гудзик»). Такий же осад повинен бути в контролі. Інтенсивність реакції виражають знаками «+».

реакція гемаглютинації

Титром вірусу є максимальне розведення матеріалу, в якому відбувається аглютинація.

Реакція гальмування гемаглютинації

Це серологічна реакція, в якій специфічні противірусні антитіла, взаємодіючи з вірусом (антигеном), нейтралізують його і позбавляють здатності агглютинировать еритроцити, т. Е. Гальмують реакцію гемаглютинації. Ця реакція дозволяє визначити вид і тип вірусів.

Постановка реакції.0,25 мл противірусної сироватки змішують з рівним об'ємом матеріалу, що містить вірус. Суміш струшують і поміщають в термостат на 30 хвилин, після чого додають по 0,5 мл'1-2% суспензії еритроцитів.

Облік результатів.При правильній постановці досвіду в контролі сироватки і еритроцитів повинна утворитися «гудзик» - немає агглютинируют еритроцити фактора; в контролі антигену утворюється «парасольку» - вірус викликав агглютинацию еритроцитів. Якщо сироватка гомологична досліджуваному вірусу, утворюється «гудзик» - сироватка нейтралізувала вірус.

Реакція непрямої гемаглютинації

Реакція непрямої (пасивної) гемаглютинації (РИГА) заснована на тому, що еритроцити, якщо на їх поверхні адсорбувати розчинний антиген, набувають здатність агглютинироваться при взаємодії з антитілами до адсорбувати антигену.

Постановка реакції.Сироватку прогрівають 30 хвилин при 56 ° С, розводять послідовно в співвідношенні 1:10 - 1: 1280 і розливають по 0,25 мл в пробірки або лунки, куди потім додають по 2 краплі еритроцитів з адсорбованими на них антигенами.

контролі:суспензія еритроцитів з адсорбованими на них антигенами зі свідомо імунною сироваткою, суспензія еритроцитів з адсорбованими на них антигенами з нормальною сироваткою; суспензія нормальних еритроцитів з випробуваної сироваткою. У першому контролі повинна відбутися аглютинація, у другому і третьому її не повинно бути.

Контрольні питання.

1. Про що свідчить позитивний результат РДА між еритроцитами і досліджуваним на наявність вірусу матеріалом?

2. Чи відбудеться реакція аглютинації еритроцитів, якщо до них додати вірус і відповідну йому сироватку? Як називається реакція, що виявляє цей феномен?

ПРАКТИЧНА РОБОТА №12.

Реакція зв'язування комплементу.

Реакція зв'язування компліменту (РСК) заснована на тому, що 'специфічний комплекс антиген - антитіло завжди адсорбує на собі (пов'язує) комплемент.

Цю реакцію широко застосовують при ідентифікації антигенів верб серодіагностики інфекцій, особливо захворювань, викликаних спірохетами (реакція Вассермана), рикетсіями і вірусами.

РКС-складна серологічна реакція. У ній беруть участь комплемент і дві системи антиген-антитіло. По суті, це дві серологічні реакції.

Права система-основна складається з антигену і антитіла (один відомий, ін. Немає). До неї додають певну кількість комплементу. За відповідності антигену і антитіла цієї системи вони з'єднаються і зв'яжуть комплімент. Утворився комплекс дрібнодисперсний і не видно.

Про освіту цього комплексу дізнаються за допомогою другої системи гемолітичної або індикаторної. У неї входять еритроцити барана (антиген) і відповідне їм гемолітична сироватка (антитіло), тобто готовий імунний комплекс. У цій системі лізис еритроцитів може статися тільки в присутності комплементу. Якщо комплемент пов'язаний першою системою, то в другій системі гемолізу НЕ буде-тому немає вільного комплементу. Відсутність гемолізу (вміст пробірки каламутне або на дні її осад еритроцитів) реєструють як позитивний результат РСК.

Якщо в першій системі антиген не відповідає антитілу, то імунний комплекс не утворюється і комплімент залишиться вільним. Що залишився вільним, комплімент бере участь у другій системі, викликаючи гемоліз, результат РСК негативний (вміст пробірок прозоро "лакова кров").

Компоненти, реакції зв'язування комплементу:

1. Антиген - зазвичай лизат, екстракт, гаптен,

рідше суспензія мікроорганізмів.

2. Антитіло - сироватка хворого.

3. Комплемент - сироватка морських свинок.

4. Антиген - еритроцити барана.

5. Антитело - гемолізин до еритроцитів барана.

6. Изотонический розчин.

З огляду на те, що в РСК бере участь велика кількість складних компонентів,

вони повинні бути попередньо відтитровані і взяті в реакцію в точних кількостях і в рівних обсягах: по 0,5 або 0,25, рідше по 0,2,1,25 або 1,0 мл (великі обсяги дають більш точний результат). Титрування компонентів реакції проводять в тому ж обсязі, в якому ставлять досвід, замінюючи відсутні інгредієнти фізіологічним розчином.

Схожа інформація:

Пошук на сайті:

Реакція непрямої або пасивної гемаглютинації (РНГА або РПГА) більш чутлива і специфічна, ніж реакція аглютинації. Цю реакцію також використовують в двох напрямках.

1) Для виявлення антитіл в сироватці крові хворого примі-ються еритроцитарні діагностикуми, в яких антиген адсорб-ваний на поверхні оброблених таніном еритроцитів. У ставлення-ванні цієї реакції частіше вживають термін РПГА.

Досліджувану сироватку розводять в лунках пластмасових план-шетов і додають еритроцитарний діагностикум. При позитивними-ної реакції з'являється тонка плівка по стінках лунки у вигляді "кру-Жевнов парасольки», при негативній реакції - щільний осад еритему-РОЦИТ у вигляді "гудзики".

2) Для виявлення токсинів і бактеріальних антигенів в дослід-ледуемом матеріалі застосовують антитільної еритроцитарні діагнос-тікуми, отримані шляхом адсорбції антитіл на еритроцитах. У від-носінні цієї реакції частіше вживається термін РНГА. Наприклад, за допомогою антитільних діагностикумів виявляють антиген па-лочки чуми, дифтерійний екзотоксин, ботулінічний екзотоксин.

Що таке еритроцитарний діагностикум? Що таке антитільний еритроцитарний діагностикум?

Еритроцитарні діагностикуми є еритроцити (оброблені таніном або формаліном) з адсорбованими на них антигенами, витягнутими з бактерій, і застосовуються в РПГА (реакції пасивної гемаглютинації). У тому випадку, коли РПГА використовується для виявлення антигену в виділеннях хворих, в тканинах і ін., Застосовують «антитільної діагностикуми», т. Е. Еритроцити, сенсибілізовані антитілами.

У РНГА виявляють антитіла сироватки крові за допомогою антигенного еритроцитарного диагностикума, який представляє собою еритроцити з адсорбованими на них антигенами.

Методика постановки реакцій. Реакція коагглютинации.

- фіксація еритроцитів формальдегідом або глютарового, або акриловим альдегидами. Такі оброблені еритроцити тривало зберігаються. Найчастіше для цієї мети використовують еритроцити барана, людини, курей та ін .;
- обробка фіксованих еритроцитів розчином таніну. В результаті еритроцити набувають властивість незворотньо адсорбувати на своїй поверхні білки (віруси і антитіла);
- сенсибілізація танізірованних еритроцитів вірусами або антитілами.

Реакція коагглютинации (РКА)

Реакцію коагглютинации застосовують для визначення антигенів за допомогою антитіл, адсорбованих на білку А клітин стафілокока (антитільний диагностикум).
Білок А має спорідненість до Fc-фрагменту імуноглобулінів, тому такі бактерії, оброблені імунної діагностичної сироваткою неспецифически адсорбируют антитіла сироватки, які потім взаємодіють активними центрами з відповідними мікробами, виділеними від хворих. В результаті коагглютинации утворюються пластівці, що складаються з стафілококів, антитіл діагностичної сироватки і визначається мікроба.

Агглютинирующие сироватки: що вони містять; як їх отримують, для чого застосовуються; що таке титр агглютинируют сироватки?

Агглютинируют сироватку отримують імунізацією кролів (внутрішньовенно, підшкірно або внутрішньочеревно) суспензією убитих бактерій, починаючи з дози 200 млн., Потім 500 млн., 1 млрд., 2 млрд., Мікробних тіл в 1 мл, з інтервалами 5 днів. Через 7-8 днів після останньої імунізації беруть кров і визначають титр антитіл.

Титром агглютинируют сироватки називається то максимальне розведення сироватки, при якому відбувається аглютинація з відповідним мікроорганізмом.

Агглютинирующие сироватки застосовуються при ідентифікації мікроба в розгорнутій реакції аглютинації.

Реакція гемаглютинації (РГА)

Якщо досліджуваний мікроорганізм аглютинується сироваткою до титру або до половини значення титру, його можна вважати належним до того виду, назва якого зазначено на етикетці ампули.

У чому відмінності між полівалентними і моновалентною (монорецепторними) аглютинативна сироватками; чому при імунізації кролика бактеріями одного виду виходить сироватка, яка містить антитіла до декількох антигенів?

Імонорецепторние сироватки - сироватки, що містять антитіла толь-ко до одного антигену, і полівалентні сироватки, що дають реакції аг-глютінаціі з двома-трьома спорідненими бактеріями, мають про-щий антиген. Агглютинирующие сироватки застосовують для ідентифікації мікроорганізмів в реакції аглютинації. Недоліком таких сироваток є те, що вони спо-собнимі давати групові реакції аглютинації, тому що вони містять ан-ника до бактерій, що має спільні антигени.

Реакція гемаглютинації. Опис і застосування

Заснована на тому, що еритроцити, на яких попередньо адсорбовані антигени, набувають здатність агглютинироваться в присутності гомологічних сироваток (антитіл).

Еритроцити при цьому виконують роль носіїв зі специфічними детермінантами, аглютинація яких відбувається в результаті реакції антиген + антитіло.

Еритроцити, до поверхні яких міцно приєднані антигени, називають еритроцитарних антигенних діагностикумів, або еритроцитами, сенсибілізованими антигеном.

Інший тип РНГА - на поверхні еритроцитів адсорбовані антитіла і подальша їх аглютинація відбувається в присутності гомологичного антигену. У цьому випадку такі еритроцити називають еритроцитарних антитільним діагностикумів, або еритроцитами, сенсибілізованими антитілами.

На основі цих двох принципових методичних підходів розроблені і використовуються багато модифікації РНГА. Так, в якості носіїв застосовують дрібні стандартні частинки латексу. В цьому випадку реакцію називають реакція латекс аглютинації (РЛА) або використовують золотистий стафілокок - реакція коагглютинации і т. Д. Зазвичай еритроцитарні діагностикуми готують на підприємствах біологічної промисловості, а в діагностичних лабораторіях ставлять вже головний досвід РНГА.

Приготування еритроцитарних діагностикумів включає наступні етапи:

фіксація еритроцитів формальдегідом або глютарового, або акриловим альдегидами. Такі оброблені еритроцити тривало зберігаються. Найчастіше для цієї мети використовують еритроцити барана, людини, курей та ін .;
обробка фіксованих еритроцитів розчином таніну. В результаті еритроцити набувають властивість незворотньо адсорбувати на своїй поверхні білки (віруси і антитіла);
сенсибілізація танізірованних еритроцитів вірусами або антитілами.

Необхідно відзначити, що методи приготування еритроцитарних діагностикумів для вірусних інфекцій різна.

Методика постановки РНГА для виявлення і визначення титру антитіл полягає в наступному:

до послідовним 2-кратним розведенням сироватки додають рівні дози еритроцитів, сенсибілізованих антигеном;
суміш залишають на 2-3 год при кімнатній температурі або на 16-18 год при 4 ° С;
враховують результати. Якщо в сироватці містяться антитіла до вірусу, яким були сенсибілізовані еритроцити, спостерігають гемаглютинацію, яку оцінюють в хрестах.

За титр антитіл в сироватці приймають найвище розведення сироватки, яке ще забезпечує гемаглютинацію не менше ніж на два хрести.

РНГА супроводжується всіма відповідними контролями. Зазвичай ставлять реакцію мікрометодом.

РНГА дозволяє вирішувати наступні діагностичні завдання:

виявити антитіла і визначити їх титр у сироватці крові за допомогою відомого еритроцитарного антигенного диагностикума;
виявити і ідентифікувати невідомий вірус за допомогою відомого еритроцитарного антительного диагностикума.

Переваги РНГА: висока чутливість, простота техніки постановки і швидкість відповіді. Однак важливо відзначити, що виникають великі труднощі в приготуванні стабільних еритроцитарних діагностикумів (велика залежність від чистоти використовуваних компонентів, необхідність підбору режиму фіксації, танізаціі і сенсибілізації еритроцитів для кожного виду вірусу).

Якщо ви знайшли помилку, будь ласка, виділіть фрагмент тексту і натисніть Ctrl + Enter.

11621 0

Серологічні реакції позначають відповідно до феноменами, які супроводжують утворення комплексу антиген - антитіло при взаємодії різних за властивостями компонентів. Розрізняють реакції аглютинації, преципітації та лізису.

Реакція аглютинації (РА)

Реакція аглютинації (РА) заснована на застосуванні корпускулярного антигену (суспензія бактерій, сенсибілізованих еритроцитів, частинок латексу та ін.), Що взаємодіє зі специфічними антитілами, в результаті чого утворюється комплекс антиген - антитіло випадає у вигляді осаду. Цю реакцію широко застосовують в лабораторній практиці для серологічної діагностики бактеріальних інфекцій і для ідентифікації виділених мікроорганізмів.

РА використовують для діагностики багатьох інфекційних хвороб: бруцельозу (реакції Райта, Хеддльсона), туляремії, лептоспірозу (РАЛ - реакція аглютинації і лізису лептоспір), лістеріозу, висипного тифу (РАР - реакція аглютинації рикетсій), шигельозу, єрсиніозу, псевдотуберкульозу та ін.

Реакція непрямої, або пасивної, аглютинації (РИГА або РПГА).

Для постановки цієї реакції використовують еритроцити тварин (барана, мавпи, морських свинок, деяких птахів), сенсибілізованих антитілами або антигеном, що досягається інкубацією суспензії еритроцитів і розчину антигену або імунної сироватки.

Діагностикуми, отримані на основі еритроцитів, сенсибілізованих антигенами, називають антигенними еритроцитарних діагностикумами. Вони призначені для визначення антитіл в серійних розведеннях сироваток крові, наприклад еритроцитарні шигеллезной діагностикуми, еритроцитарні сальмонельозні О-діагностикуми.

Відповідно діагностикуми на основі еритроцитів, сенсибілізованих специфічними імуноглобулінами, називають антитільної (Иммуноглобулинового) діагностикумамиі вони служать для виявлення антигенів в різному матеріалі, наприклад еритроцитарний іммуноглобуліновий дифтерійний диагностикум для РИГА, застосовуваний для виявлення дифтерійного екзотоксину коринебактерій в рідкому поживному середовищі при посіві в неї матеріалу з носа і ротоглотки.

Реакцію гемаглютинації застосовують для діагностики як бактеріальних (черевний тиф, паратифи, дизентерія, бруцельоз, чума, холера та ін.), Так і вірусних (грип, аденовірусні інфекції, кір та ін.) Інфекцій. За чутливості і специфічності РИГА перевершує РА.

Реакція гальмування гемаглютинації (РГГА)

Реакцію гальмування гемаглютинації (РГГА) використовують для титрування противірусних антитіл в сироватках крові, а також з метою встановлення типової приналежності виділених вірусних культур. РГГА можна застосувати для діагностики тих вірусних інфекцій, збудники яких мають гемагглютінірующімі властивостями.

Принцип методу полягає в тому, що сироватка, яка містить антитіла до конкретного типу вірусу, пригнічує його гемагглютинирующих активність і еритроцити залишаються неагглютінірованнимі.

Реакція гальмування (затримки) пасивної гемаглютинації (РТПГА).

У РТПГА беруть участь три компонента: імунна сироватка, антиген (досліджуваний матеріал) і сенсибілізовані еритроцити.

Якщо в досліджуваному матеріалі є антиген, специфічно реагує з антитілами імунної стандартної сироватки, то він пов'язує їх, і при подальшому додаванні еритроцитів, сенсибілізованих антигеном, гомологічним сироватці, гемагглютинация не настає.

РТПГА застосовують для виявлення мікробних антигенів, для кількісного їх визначення, а також для контролю специфічності РПГА.

Реакція латекс-аглютинації (РЛА)

В якості носія антитіл (імуноглобулінів) використовують частки латексу. РЛА є експрес-методом діагностики інфекційних хвороб, з огляду на час проведення (до 10 хв) і можливість виявити антиген в невеликому обсязі досліджуваного матеріалу.

РЛА застосовують для індикації антигенів Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae типу b, Neisseria meningitidis в цереброспинальной рідини, виявлення стрептококів групи А в мазках із зіву, для діагностики сальмонельозу, иерсиниозов і інших захворювань. Чутливість методу складає 1-10 нг / мл, або 10³ -10⁶ бактеріальних клітин в 1 мкл.

Реакція коагглютинации (РКоА)

Реакція коагглютинации (РКоА) заснована на здатності білка А стафілококів приєднувати специфічні імуноглобуліни. РКА - метод експрес-діагностики - служить для виявлення розчинних термостабільних антигенів в секретах людини і в складі циркулюючих імунних комплексів (ЦВК). Виявлення специфічних антигенів у складі ЦВК вимагає їх попереднього осадження з сироватки крові.

реакція преципітації

В реакції преципітації (РП) в результаті взаємодії антитіл з високодисперсними розчинними антигенами (білки, полісахариди) утворюються комплекси з участю комплементу - преципітати. Це чутливий тест, який використовується для виявлення і характеристики різноманітних антигенів і антитіл. Найпростішим прикладом якісної РП є утворення непрозорої смуги преципітації в пробірці на кордоні нашарування антигену на імунну сироватку - реакція кольцепреціпітаціі. Широко застосовують різні різновиди РП в напіврідких гелях агару або агарози (метод подвійної імунодифузії, метод радіальної імунодифузії, іммуноелектрофорез).

Реакція зв'язування комплементу (РСК)

Реакція зв'язування комплементу (РСК) заснована на феномені гемолізу за участю комплементу, тобто здатна виявляти тільки комплементсвязивающіе антитіла.

РСК широко застосовують для діагностики багатьох бактеріальних і вірусних інфекцій, риккетсиозов, хламидиозов, інфекційного мононуклеозу, протозойних інфекцій, гельмінтозів. РСК є складною серологічної реакцією, в якій беруть участь дві системи: досліджувана (сироватка крові), представлена \u200b\u200bсистемою антиген - антитіло і комплементом, і гемолітична (еритроцити барана + гемолітична сироватка). Гемолітична сироватка являє собою інактивовану прогріванням сироватку крові кролика, імунізованих еритроцитами барана. Вона містить антитіла проти еритроцитів барана.

Позитивний результат РСК - відсутність гемолізу - спостерігають в разі, якщо в досліджуваній сироватці містяться антитіла, гомологічні антигену. При цьому утворився комплекс антиген - антитіло пов'язує комплемент, а у відсутності вільного комплементу додавання гемолітичної системи не супроводжується гемолізом. У разі відсутності в сироватці антитіл, відповідних антигену, утворення комплексу антиген - антитіло не відбувається, комплемент залишається вільним і сироватка викликає гемоліз еритроцитів, тобто наявність гемолізу - це негативний результат реакції.

Ющук Н.Д., Венгеров Ю.Я.

Приготування еритроцитарних діагностикумів включає наступні етапи:

фіксація еритроцитів формальдегідом або глютарового, або акриловим альдегидами. Такі оброблені еритроцити тривало зберігаються. Найчастіше для цієї мети використовують еритроцити барана, людини, курей та ін .;
обробка фіксованих еритроцитів розчином таніну. В результаті еритроцити набувають властивість незворотньо адсорбувати на своїй поверхні білки (віруси і антитіла);
сенсибілізація танізірованних еритроцитів вірусами або антитілами.

Необхідно відзначити, що методи приготування еритроцитарних діагностикумів для вірусних інфекцій різна.

Методика постановки РНГА для виявлення і визначення титру антитіл полягає в наступному:

до послідовним 2-кратним розведенням сироватки додають рівні дози еритроцитів, сенсибілізованих антигеном;
суміш залишають на 2-3 год при кімнатній температурі або на 16-18 год при 4 ° С;
враховують результати. Якщо в сироватці містяться антитіла до вірусу, яким були сенсибілізовані еритроцити, спостерігають гемаглютинацію, яку оцінюють в хрестах.

РНГА супроводжується всіма відповідними контролями. Зазвичай ставлять реакцію мікрометодом.

РНГА дозволяє вирішувати наступні діагностичні завдання:

виявити антитіла і визначити їх титр у сироватці крові за допомогою відомого еритроцитарного антигенного диагностикума;
виявити і ідентифікувати невідомий вірус за допомогою відомого еритроцитарного антительного диагностикума.

заняття 14

Тема: Непрямі серологічні реакції. Реакції непрямої гемаглютинації (РНГА), зв'язування комплементу (РСК).

антитіла

Антитілами називаються білкові молекули, здатні до специфічного зв'язування з антигенами. Антитіла належать до гамма-глобулінів. Інша назва антитіл - імуноглобуліни. У ссавців існує 5 класів імуноглобулінів, що розрізняються за своєю будовою і деяким властивостям: IgG, IgM, IgA, IgE, IgD.

будова імуноглобулінів. Найбільш "типове" будова мають IgG. Молекула складається з 4 білкових ланцюгів: двох легких (L) і двох важких (H), які з'єднані між собою дисульфідними зв'язками. Ділянка антитіла, який зв'язується з антигеном, називається активним центром антитіла. У молекулі IgG є 2 активних центру. Він утворений N-кінцевими ділянками важкої і легкої ланцюгів. Ділянка важких ланцюгів, розташований поблизу дисульфідних зв'язків, називається шарнірної областю. За допомогою ферменту папаїну молекула IgG вище шарнірної області розщеплюється на 3 фрагмента: 2 з них містять легкий ланцюг і частина важкого ланцюга (Fab-фрагменти); а третій фрагмент складається тільки з частини важких ланцюгів (Fc-фрагмент). Завдяки рухомий шарнірної області Fab-фрагменти можуть змінювати взаємне розташування в просторі.

Амінокислотні послідовності легких і важких ланцюгів діляться на константні (постійні) і варіабельні ділянки. Варіабельні ділянки знаходяться на N-кінцях легких і важких ланцюгів (VL і VH). Константні ділянки знаходяться на С-кінцях ланцюгів (СL і СH). У легких і важких ланцюгах амінокислотні послідовності утворюють кілька глобулярних структур, які називаються доменами.

Активний центр антитіла утворюється варіабельними доменами легкої і важкої ланцюгів і являє собою порожнину ( паратоп), Що має певну конфігурацію і розподіл електричних зарядів на своїй поверхні. Розмір, форма і розподіл зарядів в активному центрі визначає його специфічність, тобто здатність зв'язуватися з певною антигенною детермінантою ( епітопом), Що має комплементарную структуру.

Антигенні детермінанти являють собою ділянки, що виступають на поверхні молекул антигенів. Тому взаємодія епітоп-паратоп відбувається за принципом "ключ-замок".

Міцність зв'язку активного центру антитіл з антигенною детермінантою характеризується поняттям аффинность. афінність - це міра спорідненості активного центру і антигенної детермінанти.

На частку імуноглобулінів класу IgG припадає 75% від загальної кількості сироваткових імуноглобулінов. Важливою властивістю IgG є їх здатність проходити через плаценту. Таким чином, материнські антитіла потрапляють в організм дитини і захищають його в перші місяці життя від інфекції (природний пасивний імунітет).

До класу IgM відноситься близько 10% загального пулу імуноглобулінів. Молекула IgM є пентамер, тобто складається з 5 однакових молекул, подібних за своєю будовою з молекулою IgG, має 10 активних центрів. Субодиниці з'єднані між собою дисульфідними зв'язками. У молекулі IgM є додаткова J-ланцюг, яка пов'язує субодиниці. Антитіла класу IgM не проходять через плацентарний бар'єр.

Антитіла класу IgА складають 15-20% від загального вмісту імуноглобулінів. Молекула IgА складається з 2-х легких і 2-х важких ланцюгів, має 2 активних центру. У сироватці крові IgА присутні в мономерной формі, тоді як в секретах слизових оболонок IgА представлені у вигляді димерів і називаються секреторними або sIgА, мають 4 активних центру. З-кінці важких ланцюгів в молекулі sIgА з'єднані між собою J-ланцюгом і білкової молекулою, яка називається секреторний компонент. Секреторний компонент захищає sIgА від розщеплення протеолітичнимиферментами, які містяться у великій кількості в секреті слизових оболонок. Основна функція sIgА - захист слизових оболонок від інфекції. IgА не проникають через плацентарний бар'єр. Висока концентрація sIgА виявляється в жіночому грудному молоці, особливо в перші дні лактації. Вони захищають шлунково-кишковий тракт новонародженого від інфекції.

IgD в основному знаходяться на мембрані В-лімфоцитів. Мають будова, подібне IgG, 2 активних центру. Біологічна роль до кінця не відома.

IgЕ - концентрація цього класу імуноглобулінів в сироватці крові надзвичайно низька. Молекули IgЕ в основному фіксовані на поверхні тучних клітин і базофілів. За своєю будовою IgЕ схожий з IgG, має 2 активних центру. Передбачається, що IgЕ має істотне значення в розвитку антігельмінтозного імунітету. IgЕ грає головну роль в патогенезі деяких алергічних захворювань (бронхіальна астма, сінна лихоманка) і анафілактичного шоку.

Реакція непрямої гемаглютинації

У непрямих серологічних реакціях комплекс антигенів з антитілами непомітний неозброєним оком. У таких випадках антигени адсорбують на більших частках-носіях (еритроцитах, частинках латексу), отримуючи антигенний еритроцитарний діагностикум. Подальша аглютинація специфічними антитілами таких частинок дозволяє бачити агглютінати (осад) неозброєним оком. Реакція непрямої (пасивної) гемаглютинації (РНГА) виявляє антитіла сироватки крові за допомогою антигенного еритроцитарного диагностикума, який представляє собою еритроцити з адсорбованими на них антигенами.

Еритроцити з адсорбованими на них антигенами взаємодіють з відповідними антитілами сироватки крові, що викликає склеювання і випадання еритроцитів на дно пробірки або осередки у вигляді фестончатого осаду. При негативній реакції еритроцити осідають у вигляді гудзики.

РНГА ставлять в пластикових планшетах або в пробірках з разведениями сироватки крові, до яких додають еритроцитарний діагностикум.

Іноді застосовують антитільний еритроцитарний діагностикум - еритроцити, на яких адсорбовані антитіла. Таку реакцію називають ронг - реакцією зворотного непрямої гемаглютинації.

Компоненти РНГА:

Сироватка крові хворого (розведення 1:25);

Еритроцитарний диагностикум (еритроцити, навантажені антигеном досліджуваного збудника);

Промивної розчин.

Постановка РНГА. О сьомій лунок планшета для імунологічних досліджень вносять по дві краплі фосфатного буферного розчину. В першу лунку додають дві краплі сироватки крові хворого, після чого з першої лунки переносять 2 краплі в другу лунку, з другої - в третю і т. Д. З шостої лунки 2 краплі видаляють. У всі сім лунок (6 досвідчених і 1 контрольну) додають по 2 краплі еритроцитарного диагностикума. Після кожної операції необхідно промивати піпетку в промивальному розчині. Планшети залишають при кімнатній температурі на 45 хвилин, після чого враховують результати.

Реакція зв'язування комплементу

Реакція зв'язування комплементу полягає в тому, що при з'єднанні антигену з антитілом утворюється імунний комплекс, до якого через Fc-фрагмент антитіл приєднується комплемент. Якщо комплекс антигену з антитілом не утворюється, то комплемент залишається вільним. Вільний комплемент виявляється додаванням до суміші гемолітичної системи, що складається з еритроцитів барана і антитіл проти них. Позитивна реакція - відсутність гемолізу в результаті зв'язування комплементу з комплексом антиген + антитіло. Негативна реакція - наявність гемолізу в результаті зв'язування комплементу з комплексом еритроцит + антиеритроцитарних антитіло.

Компоненти РСК:

Сироватка крові здорової;

Сироватка крові хворого (в розведенні 1: 5);

Антигенний компонент реакції - інактивований збудник;

Комплемент в розведенні, відповідному робочої дозі. Комплемент отримують з сироватки крові морської свинки. Титром комплементу є його мінімальна доза, яка в присутності гемолітичної сироватки викликає повний гемоліз еритроцитів. Робоча доза комплементу, яка використовується при постановці РСК, на 30% більше його титру;

Гемолітична система - суспензія еритроцитів барана, оброблених кролячими антитілами до еритроцитів барана.

Розчин для промивання.

Постановка РСК. РСК ставлять в двох пробірках - дослідної та контрольної. У дослідну пробірку вносять 0,5 мл сироватки крові хворого, в контрольну пробірку вносять 0,5 мл сироватки крові здорового донора, в обидві пробірки вносять по 0,5 мл лизата збудника, а також по 0,5 мл комплементу. Після кожної операції необхідно промивати піпетку в промивальному розчині. Пробірки поміщають в термостат при температурі 37 ° С на 30 хвилин. Після інкубації в обидві пробірки вносять по 1,0 мл гемолітичної системи. Пробірки струшують і поміщають в термостат при температурі 37 ° С на 30 хвилин. При позитивній реакції в дослідній пробірці відзначається затримка гемолізу (рідина безбарвна і осад еритроцитів), в контрольній пробірці - гемоліз еритроцитів.

Література для підготовки до заняття:

1. Борисов мікробіологія, вірусологія, імунологія. , 2002.

2. Медична мікробіологія, вірусологія та імунологія. Під ред. . М., 2004.

3. Поздеев мікробіологія. М., ГЕОТАР-МЕДІА, 2005.