РИФ

Реакція імунофлюоресценції заснована на взаємодії противохламидийной АТ з родоспеціфіческому хламідійним антигеном. Існує два типи реакції імунофлюоресценції - прямий і непрямий. У першому випадку безпосередньо специфічне антитіло мечено флюорохромом і реакція проходить в один етап, що значно скорочує терміни дослідження. У другому випадку специфічне антитіло не має мітки, а для виявлення комплексу АГ-АТ, що утворився на першому етапі, використовують другі мічені антитіла, специфічні до антихламідійний антитіл. Результат реакції оцінюють візуально за допомогою люминисцентного мікроскопа.

Крім імпортних з'явилися вітчизняні набори для діагностики хламідійної інфекції реакцією прямої імунофлюоресценції, які практично не поступаються по специфічності і чутливості, але мають значно нижчу ціну.

Матеріалом для дослідження служать мазки-відбитки, приготовані з дотриманням правил. Мазки для РИФ готуються на спеціальних деколірованних стеклах в межах обмеженою майданчики діаметром 8 - 10 мм. Після цього їх висушують на повітрі і фіксують, занурюючи на 5 - 10 хвилин в холодний 96% (краще абсолютний) етиловий спирт або наносячи на препарат 0.1 - 0.15 мл охолодженого безводного ацетону до повного його випаровування. Фіксовані препарати можна досліджувати відразу або при необхідності зберігати при кімнатній температурі протягом доби або при -20 ° С протягом 2 тижнів (при цьому необхідно виключити доступ вологи при зберіганні і доведенні препарату до кімнатної температури перед дослідженням за допомогою поліетиленового пакета і Селикагель).

При проведенні прямої РИФ на препарат наносять розчин мічених антитіл в кількості, необхідній для повного покриття мазка (25 - 30 мкл). Препарат инкубируют в горизонтальному положенні у вологій камері протягом 15 хвилин при + 37 ° С. Підсихання реагенту неприпустимо, щоб уникнути хибнопозитивних результатів. Далі мазок промивають в проточній воді 30 сек, прополіскують в дистильованої воді, висушують і готують до мікроскопії.

При проведенні непрямої РІФ на препарат наносять необхідну кількість розчину антихламідійний антитіл і проводять першу інкубацію в тих же умовах, що і при проведенні прямої РИФ. Потім препарат промивають, висушують на повітрі і наносять другий реагент - мічені антитіла до хламідійним АТ і проводять другу інкубацію так само у вологій камері при + 37 ° С 15 хвилин. Після промивання препарат висушують і готують до мікроскопії. Готові препарати рекомендується переглядати відразу. При необхідності можливе зберігання забарвлених препаратів протягом 1 - 2 діб при + 2-8 ° С в темному місці без доступу вологи.

Мікроскопію проводять з використанням імерсійної системи. Можливі два варіанти иммерсионной мікроскопії:

1. Масляна іммерсія: На готові висушений препарат наносять 20 - 25 мкл монтують рідини (гліцерин, забуферений фосфатним буфером з рН 7.2 - 7.6), покривають його знежиреним покривним склом, на яке потім наносять краплю нефлюоресцерующего иммерсионного масла і проводять мікроскопію об'єктивом (маркування "Л "- люмінісцентний) зі збільшенням 90 і окуляром зі збільшенням 5.

2. Водна іммерсія: на готовий препарат наносять краплю 20 мкл фосфатного буфера з рН 7.4 і проводять мікроскопію об'єктивом для водної імерсії (маркування - біла смуга і "Л" - люмінісцентний) зі збільшенням 60 і окуляром зі збільшенням 5. Водна іммерсія дає більш рівне, яскраве і чітке світіння.

РИФ дозволяє виявляти антигенні структури як елементарних, так і ретикулярних тілець. ЕТ розташовані переважно внеклеточно, округлої форми з рівними краями, дрібні (розмір 1: 100 - 1: 150 по відношенню до оточуючих їх клітин), однорідної структури, мають яскраве специфічне смарагдово-зелене свічення, яке при роботі мікрогвинти може давати дифракційні кільця (кільця Ділекторского). РТ зустрічаються значно рідше, розташовуються переважно внутрішньоклітинно, мають менш однорідну структуру, більш поліморфні, але також з чіткими краями і мають яскравим специфічним смарагдово-зеленим світлом. Будь-який інший флюоресцирующий матеріал неправильної форми, нерівними нечіткими краями, що має неяскраву зелене забарвлення, або світіння іншого кольору відноситься до артефактів. Інтенсивність, яскравість і відтінок специфічного світіння залежить від рН монтують рідини або буфера використовуваного для мікроскопії. Велика інтенсивність світіння ФИТЦ в лужному середовищі збільшує чутливість методу, але веде до збільшення числа об'єктів з неспецифічним світінням, а, отже, до хибнопозитивних результатів. У кислому середовищі інтенсивність світіння ФИТЦ падає, що може дати помилково негативний результат. Супутня мікрофлора, а також ядра оточуючих клітин неспецифически фарбуються в різні відтінки оранжевого кольору бромистим индием, їх цитоплазма - в різні відтінки цегляно-коричневого кольору синькою Еванса.

Для отримання достовірного результату рекомендується переглядати багато поля зору препарату. Результат вважається позитивним в тому випадку, якщо препарат містить клітини епітелію і вдається виявити не менше 6 елементарних тілець, що мають всі перераховані вище ознаки.

Виявлення меншої кількості збудника робить результат сумнівним і вимагає повторного дослідження, бажано на тлі провокації (харчова - алкоголь, медикаментозна - ін'єкція пирогенала, механічна - масаж уретри на буже). Контроль вилікування слід проводити не раніше ніж через два тижні, так як можливе збереження НЕ виключеного антигенного матеріалу нежиттєздатного збудника, що буде давати хибнопозитивні результати. Отримання 3 негативних результатів дослідження у чоловіків протягом місяця і у жінок протягом 3 менструальних циклів, відсутність клінічних проявів хламідійної інфекції свідчить про одужання.

РИФ при правильній підготовці пацієнта, дотриманні правил взяття матеріалу і постановки реакції є високочутливим і специфічним методом діагностики урогенітального хламідіозу і дозволяє виявляти збудника у 90 - 95% хворих. Даний метод відносно дешевий, простий у виконанні, високоінформатівен, не вимагає спеціального дорогого устаткування, дозволяє швидко отримати результат (0.5 - 1 година) і візуально контролювати якість взяття матеріалу для дослідження.

Методи, що використовує методи молекулярної біології

До групи входять методи ДНК-зондів і полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), які дозволяють виявити генетичний матеріал збудника в досліджуваному біоматеріалу. Набори для діагностики хламідіозу ДНК-зондами знаходяться поки на стадії розробки і клінічних випробувань.

ПЛР активно впроваджується в практику лабораторної діагностики. Метод заснований на виділенні специфічної послідовності ДНК або РНК збудника за допомогою комплементарних праймерів, подальшого її багаторазового копіювання та накопичення для подальшого виявлення звичайними методами детекції (електрофорез або ІФА). Даний метод має високу специфічність і чутливість, практично наближається до культуральному і дозволяє виявити одиничних збудників в досліджуваному матеріалі. Метод ПЛР вимагає спеціального дорогого устаткування, окремої спеціально оснащеній лабораторії, відповідної підготовки та високої кваліфікації медичного персоналу. Разом з тим, відсутність сертифікації використовуваних в Росії праймерів і достатнього досвіду застосування методу ПЛР, специфічність досліджуваного матеріалу, часта його контамінація супутньої мікрофлорою (що може давати хибно позитивні результати) не дозволяє однозначно судити про його цінності при діагностиці урогенітального хламідіозу.

Таким чином, в даний час найбільш доступним, простим і в той же час високоінформативним методом діагностики урогенітального хламідіозу і встановлення вилікування є реакція прямої імунофлюоресценції (РІФ). Контроль за динамікою перебігу захворювання та ефективністю лікування слід проводити, визначаючи титр антихламідійний антитіл в сироватці крові методом імуноферментного аналізу (ІФА).

Реакція імунофлюоресценції (РІФ) - серологічна реакція, що дозволяє виявити антитіла до відомим антигенів. Метод полягає в мікроскопії забарвлених мазків.

Дану реакцію використовують в імунології, вірусології та мікробіології. Вона дозволяє визначити наявність вірусів, бактерій, грибів, найпростіших і ВКК. РИФ дуже широко застосовується в діагностичній практиці для виявлення вірусних і бактеріальних антигенів в інфекційному матеріалі. Метод заснований на здатності флюорохромами вступати в зв'язок з білками, не порушуючи при цьому їх імунологічної специфічності. В основному застосовується при діагностиці інфекцій сечостатевих шляхів.

Розрізняють такі методи проведення реакції імунофлюоресценції: прямий, непрямий, з комплементом. Прямий метод полягає у фарбуванні матеріалу флюорохромами. Завдяки здатності антигенів мікробів або тканин світитися в УФ-променях люмінесцентного мікроскопа, вони визначаються як клітини з яскраво забарвленою облямівкою зеленого кольору.

Непрямий метод полягає у визначенні комплексу антиген + антитіло. Для цього досвідчений матеріал обробляється антитілами антимікробної кролячій сироватки, призначеної для діагностики. Після того як антитіла зв'яжуться з мікробами, їх відділяють від не пов'язаної і обробляють антикроличьих сироваткою, поміченої флюорохромом. Після цього комплекс мікроб + анімікробние антитіла + анітікролічьі антитіла визначається за допомогою ультрафіолетового мікроскопа також, як і при прямому методі.

Реакція імунофлюоресценції незамінна при діагностиці сифілісу. Під впливом флюорохромами збудник сифілісу визначається як клітина з жовто-зеленою облямівкою. Відсутність світіння означає, що пацієнт не заражений сифілісом. Цей аналіз часто призначається при позитивній реакції Вассермана. Даний метод дуже ефективний при діагностиці, так як дозволяє визначити збудника на ранніх стадіях захворювання.

Крім того, що РИФ дозволяє діагностувати сифіліс, його також застосовують для визначення наявності таких збудників як хламідії, мікоплазма, трихомонади, а також збудників гонореї і генітального герпесу.

Для проведення аналізу використовують мазки або венозну кров. Процедура взяття мазка абсолютно безболісна і не представляє ніякої небезпеки. До здачі даного аналізу необхідно підготуватися. За дванадцять годин до нього не рекомендується користуватися засобами гігієни, такими як мало або гелі. Також іноді за свідченнями лікаря проводитися провокація. Для цього рекомендують прийом гострої їжі або алкоголю або проводиться ін'єкція провокуючого речовини, наприклад гоновакціна або пірогенал. Крім цього проміжок між прийомом антибактеріальних препаратів і здачею аналізу повинен бути не менше чотирнадцяти днів.

При оцінці результатів слід враховувати той факт, що світіння спостерігається не тільки у живих бактерій, але і у мертвих, особливо це відноситься до хламідій. Після курсу антибіотиків мертві клітини хламідій також мають світінням.

При правильній підготовці пацієнта і дотриманні техніки взяття мазка, даний аналіз дозволяє визначити захворювання на ранніх стадіях, що дуже важливо для своєчасного лікування. Позитивними сторонами даного методу є короткі терміни отримання результату, простота виконання і невисока вартість аналізу.

До недоліків можна віднести те, що для проведення аналізу необхідно досить велика кількість досліджуваного матеріалу. Крім того, оцінку результатів може проводити тільки досвідчений фахівець.

Імунофлюоресцентний метод (РІФ, реакція імунофлюоресценції, реакція Кунса) - метод виявлення специфічних Аг за допомогою Ат, кон'югованих з флюорохромом. Володіє високою чутливістю і специфічністю.

Застосовується для експрес-діагностики інфекційних захворювань (ідентифікація збудника в досліджуваному матеріалі), а також для визначення Ат і поверхневих рецепторів і маркерів лейкоцитів (иммунофенотипирование) і ін. Клітин.

Виявлення бактеріальних і вірусних антигенів в інфекційних матеріалах, тканинах тварин і культурах клітин за допомогою флуоресцентних антитіл (сироваток) набуло широкого застосування в діагностичній практиці. Приготування флюоресцирующих сироваток засноване на здатності деяких флюорохромів (наприклад, ізотіоціанати флюоресцеіна) вступати в хімічний зв'язок з сироватковими білками, не порушуючи їх імунологічної специфічності.

Розрізняють три різновиди методу: прямий, непрямий, з комплементом. Прямий метод РІФ заснований на тому, що антигени тканин чи мікроби, оброблені імунними сироватками з антитілами, міченими флюорохромами, здатні світитися в УФ-променях люмінесцентного мікроскопа. Бактерії в мазку, оброблені такою люминесцирующей сироваткою, світяться по периферії клітини у вигляді облямівки зеленого кольору.

Непрямий метод РІФ полягає у виявленні комплексу антиген - антитіло за допомогою антіглобуліновой (проти антитіла) сироватки, міченої флюорохромом. Для цього мазки з суспензії мікробів обробляють антитілами антимікробної кролячій діагностичної сироватки. Потім антитіла, які не зв'язалися антигенами бактерій, відмивають, а що залишилися на мікроби антитіла виявляють, обробляючи мазок антіглобуліновой (антикроличьих) сироваткою, міченої флюорохромами. В результаті утворюється комплекс мікроб + антимікробні кролячі антитіла + антикроличьих антитіла, мічені флюорохромом. Цей комплекс спостерігають в люмінесцентному мікроскопі, як і при прямому методі.

Механізм. На предметному склі готують мазок з досліджуваного матеріалу, фіксують на полум'ї і обробляють імунної кролячої сироваткою, що містить антитіла проти антигенів збудника. Для утворення комплексу антиген - антитіло препарат поміщають у вологу камеру і інкубують при 37 ° С протягом 15 хв, після чого ретельно промивають фізіологічним розчином хлориду натрію для видалення не пов'язаних з антигеном антитіл. Потім на препарат наносять флюоресцирующую антіглобуліновой сироватку проти глобулінів кролика, витримують протягом 15 хв при 37 ° С, а потім препарат ретельно промивають фізіологічним розчином хлориду натрію. В результаті зв'язування флюоресцирующей антіглобуліновой сироватки з фіксованими на антигене специфічними анти тілами утворюються світяться комплекси антиген - антитіло, які виявляються при люмінесцентної мікроскопії.

4. У повітрі дитячої спальні ясел виявлено 75 мт / м3 стрептокока, 12 мт / м3 стафілокока і 1 мт / м3 туберкульозних бактерій. Дати санітарно-бактеріологічну оцінку повітря і намітити план його санації.

Екзаменаційний білет № _54

Ретровіруси. ВІЛ-інфекція (СНІД), і її збудники.

Вірус імунодефіциту людини викликає ВІЛ-інфекцію, що закінчується розвитком синдрому набутого імунного дефіциту.

Збудник ВІЛ-інфекції - лімфотропний вірус, що відноситься до сімейства Retroviridae роду Lentivirus.

Морфологічні властивості: РНК-вірус. Вірусна частка сферичної форми Оболонка складається з подвійного шару ліпідів, пронизаного гликопротеинами. Ліпідна оболонка відбувається з плазматичної мембрани клітини господаря, в якій репродукується вірус. Глікопротеїновими молекула складається з 2 субодиниць, які перебувають на поверхні віріона і пронизують його липидную оболонку.

Серцевина вірусу конусоподібної форми, складається з капсидних білків, ряду матриксних білків і білків протеази. Геном утворює дві нитки РНК, для здійснення процесу репродукції ВІЛ має зворотну транскриптазу, або ревертазу.

Геном вірусу складається з 3 основних структурних генів і 7 регуляторних і функціональних генів. Функціональні гени виконують регуляторні функції і забезпечують здійснення процесів репродукції і участь вірусу в інфекційному процесі.

Вірус вражає в основному Т-і В-лімфоцити, деякі клітини моноцитарного ряду (макрофаги, лейкоцити), клітини нервової системи.

Культуральні властивості: на культурі клітин Т-лімфоцитів і моноцитів людини (в присутності ІЛ-2).

Антигенна структура: 2 типу вірусу - ВІЛ-1 і ВІЛ-2 ВІЛ-1, має більше 10 генотипів (субтипов): А, В, С, D, E, F ..., що відрізняються між собою за амінокислотним складом білків.

ВІЛ-1 ділять на 3 групи: М, N, О. Більшість ізолятів належить до групи М, в якій виділяють 10 підтипів: А, В, С, D, Fl, F-2, G, Н, I, К. Стійкість : Чутливий до фізичних і хімічних факторів, гине в при нагріванні. Вірус може тривалий час зберігатися у висушеному стані, в висохлої крові.

Фактори патогенності, патогенез: Вірус прикріплюється до лімфоцити, проникає в клітину і репродукується в лімфоцит. В результаті розмноження ВІЛ в лімфоцит останні руйнуються або втрачають свої функціональні властивості. В результаті розмноження вірусу в різних клітинах відбувається накопичення його в органах і тканинах, і він виявляється в крові, лімфі, слині, сечі, поті, калових масах.

При ВІЛ-інфекції знижується число Т-4-лімфоцитів, порушується функція В-лімфоцитів, пригнічується функція природних кілерів і відповідь на антигени знижується і порушується продукція комплементу, лімфокінів та інших факторів, що регулюють імунні функції (ІЛ), в результаті чого настає дисфункція імунної системи.

Клініка: уражається дихальна система (пневмонія, бронхіти); ЦНС (абсцеси, менінгіти); Шлунково-кишкового тракту (діареї), виникають злоякісні новоутворення (пухлини внутрішніх органів).

ВІЛ-інфекція протікає в кілька стадій: 1) інкубаційний період, що становить в середньому 2-4 тижні; 2) стадія первинних проявів, що характеризується спочатку гострої лихоманкою, діареєю; завершується стадія безсимптомної фазою і персистенцією вірусу, відновленням здоров'я, проте в крові визначаються ВІЛ-антитіла, 3) стадія вторинних захворювань, що проявляються ураженням дихальної, нервової системи. Завішані ВІЛ-інфекція останньої, 4-й термінальній стадіей- СНІДом.

Лабораторна діагностика.

Вірусологічні та серологічні дослідження включають методи визначення антигенів і антитіл ВІЛ. Для цього використовують ІФА, ІБ і ПЛР. Сироватки хворих на ВІЛ-1 і ВІЛ-2 містять антитіла до всіх вірусних білків. Однак для підтвердження діагнозу визначають антитіла до білків gp41, gpl20, gpl60, p24 у ВІЛ-1 і антитіла до білків gp36, gpl05, gpl40 у ВІЛ-2. ВІЛ-антитіла з'являються через 2-4 тижні після інфікування і визначаються на всіх стадіях ВІЛ.

Метод виявлення вірусу в крові, лімфоцитах. Однак при будь-позитивній пробі для підтвердження результатів ставиться реакція ІБ. Застосовують також ПЛР, здатну виявляти ВІЛ-інфекцію в інкубаційному і ранньому клінічному періоді, однак її чутливість трохи нижче, ніж у ІФА.

Клінічний і серологічний діагнози підтверджуються імунологічними дослідженнями, якщо вони вказують на наявність імунодефіциту у обстежуваного пацієнта.

Діагностична імуноферментна тест-система для визначення антитіл до ВІЛ - включає вірусний АГ, адсорбований на носії, АТ проти Ig людини. Використовується для серодиагностики СНІДу.

Лікування: застосування інгібіторів зворотної транскриптази, що діють в активованих клітинах. Препарати є похідні тимідину - азидотимидин і Фосфазід.

Профілактика. Специфічна - немає.

Вплив фізичних і хімічних факторів на мікроби. Мутація і її значення для практичної медицини. Приклади. Значення екології.

Дія хімічних і біологічних факторів.

Дія хімічних речовин

Хімічні речовини можуть гальмувати або повністю пригнічувати ріст мікроорганізмів. Якщо хімічна речовина пригнічує ріст бактерій, але після видалення їх зростання знову відновлюється.

Протимікробні речовини з урахуванням хімічної будови і механізму їх бактерицидної дії на бактерії можна поділити на такі групи: окислювачі, галогени, сполуки металів, кислоти і луги, поверхнево-активні речовини, спирти, фарбники, похідні фенолу і формальдегіду.

Окислювачі. До цієї групи належать перекис водню і калію перманганат.

Галогени. Хлор, йод і їх препарати: хлорне вапно, хлорамін Б, пантоцид, розчин йоду спиртовий 5% -ний, йодинол, йодоформ.

Сполуки важких металів (солі свинцю, міді, цинку, срібла, ртуті; металлорганические з'єднання срібла: протаргол, колларгол). Ці сполуки здатні надавати як протимікробний, так і різнохарактерних місцеву дію на тканини макроорганізму.

Кислоти і луги. В основі бактерицидного дії кислот і лугів лежать дегідратація мікроорганізмів, зміна рН живильного середовища, гідроліз колоїдних систем і утворення кислотних або лужних альбуминатов.

Барвники мають властивості затримувати ріст бактерій. Вони діють повільно, але більш вибірково.

Формальдегід-безбарвний газ. У практиці застосовують 40% -ний водний розчин формальдегіду (формалін). Газоподібний і розчинений у воді формальдегід згубно впливає на вегетативні і спорові форми бактерій.

Дія біологічних факторів

Дія біологічних факторів проявляється насамперед у антагонізмі мікробів, коли продукти життєдіяльності одних мікробів зумовлюють загибель інших.

Антибіотики (від грец. Anti - проти, bios - життя) - біологічно активні речовини, що утворюються в процесі життєдіяльності грибів, бактерій, тварин, рослин і створені синтетичним шляхом, здатні вибірково пригнічувати і вбивати мікроорганізми, гриби, рикетсії, великі віруси, найпростіші і окремі гельмінти.

3. Реакція біологічної активності бактеріальних ферментів при ревматизмі, діагностичне та практичне значення, захисна роль антитіл проти ферментів в набутому імунітеті (визначення антігіалуронідази і анти О-стрептолізин).

Ревматизм - загальне захворювання інфекційно-алергічного характеру, при якому вражається сполучна тканина, головним чином серцево-судинної системи, а також суглоби, внутрішні органи, центральна нервова система. Вважається, що причиною розвитку ревматизму є активація патогенних мікроорганізмів, головним чином бета-гемолітичного стрептокока групи А. Саме йому відводиться головна роль в етіології і патогенезі ревматичної хвороби. По-перше, захворювання розвивається на тлі стрептококової інфекції. По-друге, в крові хворих виявляється велика кількість антитіл до мікроорганізмів цієї групи. По-третє, профілактика захворювання успішно проводиться антибактеріальними препаратами.

При ревматоїдному артриті синовіальні мембрани, з нез'ясованих причин, секретують велику кількість ферменту глюкозо-6-фосфат дегідрогенази яка також руйнує дисульфідні зв'язку в клітинній мембрані. При цьому спостерігається «витік» протеолітичних ферментів з клітинних лізосом, які викликають пошкодження прилеглих кісток і хрящів. Організм відповідає на це шляхом вироблення цитокінів, серед яких також є фактор некрозу пухлини α TNF-α. Каскади реакцій в клітинах, які запускаються цитокінами, ще більше посилюють симптоми хвороби. Хронічне ревматоїдне запалення, асоційоване з TNF-α, дуже часто викликає ушкодження хрящів і суглобів, що ведуть до фізичної непрацездатності.

Зміст:

прямі способи

Мікроскопія в темному полі

Блідітрепонеми не можуть рости на поживних середовищах і не візуалізуються під світловим мікроскопом. Так як виявлення патогена за допомогою звичайної мікроскопії неможливо, застосовують спеціальний мікроскоп з темним полем, де збудник видно у вигляді спіралі на темному тлі.

Для проведення мікроскопії забирається біоматеріал з підозрілого на захворювання вогнища. Мікроскопія в темному полі - це можливий спосіб оцінки шкірних поразок, таких як шанкр первинного сифілісу або кондилома вторинного сифілісу. Якщо матеріал макулопапулезного вогнища сухий, досліджують аспірат лімфатичного вузла.

Негативний результат не виключає патологічний процес, статистично виявлення збудника можливо тільки в 80%.

ПЛР-діагностика

Реакція, спрямована на багаторазове збільшення ДНК блідої трепонеми, дозволяє зробити висновок про інфікування сифілісом або про його відсутність.

Біоматеріал для аналізу може бути будь-яким: кров, вміст сифилида, спинномозкової рідини та ін. Тест підходить для інкубаційного періоду.

ПЛР повністю специфічна.

Непрямі серологічні аналізи на сифіліс: трепонемні і нетрепонемні тести

Серологічні аналізи (КСР або комплекс серологічних реакцій) вважаються найбільш поширеним способом для діагностики всіх стадій сифілісу. Виділяють наступні реакції:

• аглютинації;
• преципітації;
• імунофлюоресценції;
• імуноферментний аналіз та ін.

Також серологічні аналізи на сифіліс поділяють на трепонемні і нетрепонемні.

нетрепонемні

При підозрі на набутий сифіліс виконують скринінгове тестування, для чого використовують нетрепонемні тести , Що визначають антитіла до ліпоїдним антигенів тканин господаря або збудника в різноманітних модифікаціях. У РФ рутинно виконують реакцію мікропреципітації (РМП), яка дозволяє виявити антитіла до пошкоджених патогеном клітинам в крові. Достовірність скринінгу висока, але специфічність невелика, тому тестування підходить для первинного масового обстеження в превентивних цілях.

Чутливість експрес-тестів оцінюється в 78-86% для виявлення первинного сифілісу, 100% для вторинного сифілісу і 95-98% для виявлення третинного сифілісу.

Специфічність - від 85-99%, іноді-менш, що зустрічається при наступних станах:

• гестації;
• менструація;
• онкологія;
• захворювання сполучної тканини;
• вірусні захворювання;
• хвороби печінки;
• вакцинація;
• «Свіжий» ІМ;
• висипний тиф і ін.

Крім цього, надлишок жирів у раціоні, вживання спиртовмісних напоїв і прийом деяких ліків можуть привести до ложноложітельним висновками.

Результати скринінгового тестування стають позитивними через 1-2 тижні після утворення шанкра. Нетрепонемні тести дають негативну відповідь через деякий час після лікування. При ВІЛ-статус нетрепонемні антитіла можуть виявлятися довго, іноді протягом усього життя (що підтверджується результатами відповідного рандомізірованнного дослідження).

Інші різновиди нетрепонемних аналізів: VDRL, плазмореагіновий тест (RPR), проба з толуїдиновим червоним, реакція зв'язування комплементу з кардіоліпіновим антигеном (РСКк).

Реакція Вассермана (RW)

Зв'язування комплементу - відповідь імунної системи на інфікування, результат варіюється від негативного (ставиться «-»), до різко позитивного «++++» або 4 плюса.

У початковій стадії первинного сифілісу RW негативна.

трепонемні

Через можливість хибнопозитивних результатів для підтвердження будь-якого позитивного або сумнівного результату нетрепонемних аналізу, використовують трепонемні тести:

• реакція імунофлюоресценції (РІФ);
• гемагглютинация (РПГА),
• імуноферментний аналіз (ІФА) для імуноглобулінів класу G (IgG) і імуноглобуліну М (IgM);
• імуноблотинг;
• ІБТ / РІТ (реакція іммобілізації блідих трепонем).

Трепонемні тести не використовуються для оцінки ефективності терапії.

РИФ на визначення трепонемним АТ класу IgG застосовують після позитивного результату експрес-аналізів (чутливість 84% для первинного сифілісу і 100% при інших стадіях, специфічність 96%). Для діагностики у новонароджених не застосовні.

У деяких лабораторіях використовують «зворотні» скринінгові дослідження.

CDC (Centers for Disease Control and Prevention, США) рекомендує традиційні дослідження, з перевіркою кількісними нетрепонемних тестами, при позитивному результаті проводиться лікування.

Реакція імунофлюоресценції (РІФ)

На зібраний матеріал наносять сироватку з міченими флюорохромом антитілами, специфічними до антигену блідої трепонеми, збудник притягує до себе імунні комплекси, через що починає світитися в люмінесцентному мікроскопі.

Реакція пасивної гемоагглютінаціі або РПГА

До появи гемаглютинації (склеювання) еритроцитів з моменту впровадження блідої трепонеми повинно пройти не менше 4 тижнів.

Підготовлені еритроцити з фіксованими білковими фракціями патогена взаємодіють з плазмою, якщо є антитіла до сифілісу, відбувається реакція.

Підходить для підтвердження будь-якій стадії захворювання.

імуноферментний аналіз

В основу покладена реакція антиген-антитіло. Виявляються антитіла різних класів, які можна оцінити кількісно.

Отримані результати дозволяють судити про тривалість патологічного процесу, успішності проведеного лікування, імунологічному статусі, активності збудників.

Імуноблотинг - різновид ІФА, застосовують для поглибленої діагностики при всіх сумнівних результатах.

Чутливість і специфічність близька до 100%, на сьогоднішній день ультрачутлива метод ідентифікації білків.

ІБТ

Спосіб заснований на реакції антиген-антитіло. Антигеном служать блідітрепонеми, культивовані в тестикулах кролика. При взаємодії з антитілами зараженої людини, патогени втрачають рухливість. Реакція оцінюється за допомогою мікроскопії в темному полі.

Зверніть увагу

ІБТ в даний час застосовують через трудомісткість рідше, але аналіз може бути корисний для вирішення спірних питань (хибнопозитивні реакції на сифіліс).

Диференціальна діагностика

Найбільшу складність представляє діагностика третинного сифілісу, що обумовлюється симптомами з боку серцево-судинної і нервової системи, а також проявами з боку шкірного покриву.

Пацієнти обов'язково повинні бути обстежені на, і.

Перерахуємо захворювання, з якими проводять диференційну діагностику при сифілісі:

• дерматологічні прояви;
• генітальні бородавки ();
• донованоз;
• венерична лімфогранульома;
• вірус;
• фрамбезия.

З чого починається діагностика сифілісу

Спочатку проводиться бесіда з пацієнтом, під час якої уточнюються деталі: коли був підозрілий статевий контакт і які є скарги.

Після збору анамнезу переходять до фізикальному огляду, особлива увага приділяється області геніталій і ануса, слизових оболонок і лімфатичних вузлів. Попередній діагноз вже може бути встановлений. Остаточна верифікація відбувається за допомогою лабораторних аналізів.

Якщо сказати просто про складне, то одні аналізи виявляють збудника сифілісу, а інші відображають реакцію організму на впровадження блідої трепонеми.

Для установки остаточного діагнозу РПГА слід доповнити 1 трепонемним і 1 нетрепонемних аналізом.

Діагностика сифілісу у вагітних

Проводяться обов'язкове дослідження на сифіліс кілька разів протягом вагітності.

Направлення на аналіз КСР видається під час першого візиту жінки в консультацію, і за час вагітності тричі виконується обстеження. Пацієнтки з високою групи ризику з обтяженим анамнезом:, асоціальні, залежні та ін. Вимагають особливо пильної уваги.

Якщо результати аналізу позитивні, проводять більш глибоку діагностику, і за показаннями призначають лікування, яке залежить від стадії і клінічних проявів.

Діагностика вродженого сифілісу

Більшість дітей з народжуються у нелікованих матерів, або які отримали терапію занадто пізно.

Трепонемні тести з використанням неонатальної сироватки не рекомендуються через пасивне перенесення антитіл IgG. Всі діти, народжені від матерів з сифілісом, повинні обстежитися за допомогою кількісного нетрепонемних серологічного тесту (RPR або VDRL), виконаного з використанням сироватки крові новонародженого.

Як трактувати результати серологічних досліджень

Реакція мікропреципітації, РІФ і РПГА негативні - норма, позитивні - підтвердження сифілісу.

Реакція мікропреципітації негативна, інші позитивні - сифіліс в анамнезі після проведення специфічної терапії, або пізня стадія.

Негативна РИФ при позитивних РПГА і реакції мікропреципітації - результат викликає сумніви, повторна комплексна оцінка.

Негативний результат РИФ і мікропреципітації, але позитивна РПГА - стан після успішної антибіотикотерапії або хибнопозитивний результат.

Позитивна РИФ при негативних РПГА і реакції мікропреципітації - рання стадія, проведене лікування або недостовірність результату.

Позитивна реакція мікропреципітації, не підтверджена ні РПГА, ні РИФ - відсутність сифілісу.

Інструментальне дослідження при сифілісі

Інструментальна діагностика проводиться в залежності від залучення органів. Наприклад, гранулематозное ураження печінки можна побачити при черевної порожнини.

У пацієнтів з третинним сифілісом може показати дилатацію аорти. Лінійна кальцифікація по ходу аорти свідчить на користь аортіта.

В даний час широко застосовуються серологічні реакції (СР), в яких беруть участь мічені АГ або АТ. До них відносяться реакція імунофлюоресценції, радіоімунний і імуноферментний методи, реакція иммуноблотинга, проточна цитометрії та електронна мікроскопія.

Вони застосовуються:

1) для серодиагностики інфекційних захворювань, т. Е. Для виявлення АТ за допомогою набору відомих кон'югованих (хімічно з'єднаних) з різними мітками (ферментами, флюорохромних барвниками), антигенів;

2) для визначення мікроорганізму або його серовара за допомогою стандартних мічених діагностичних антитіл (експрес-діагностика).

Готують діагностичні сироватки імунізацією тварин відповідним АГ, потім виділяють імуноглобуліни і кон'югують їх з світяться барвниками (флюорохромами), ферментами, радіоізотопами.

Діагностичних моноклональних антитіл отримують за допомогою гібридних клітин, утворених шляхом злиття імунного В-лімфоцити з миеломной кліткою. Гібридоми здатні швидко розмножуватися in vitro в культурі клітин і продукувати при цьому імуноглобулін, характерний для взятого В-лімфоцити.

Мічені СР по специфічності не поступаються іншим СР, а по своїй чутливості вони перевершують всі НГ.

Реакція імунофлюоресценції (РІФ)

В якості мітки використовуються світяться флюорохромних барвники (ізотіоціонат флюоресцеіна і ін.).

Існують різні модифікації РІФ. Для експрес - діагностики інфекційних захворювань - для виявлення мікробів або їх антигенів в досліджуваному матеріалі застосовується РИФ по Кунсу.

Виділяють два методи РІФ по Кунсу: прямий і непрямий.

Компоненти прямий РИФ:

1) досліджуваний матеріал (випорожнення, виділення носоглотки та ін.);

2) мічена специфічна імунна сироватка, яка містить АТ до шуканого антигену;

3) ізотонічний розчин хлориду натрію.

Мазок з досліджуваного матеріалу обробляють міченої антисироватки.

Відбувається реакція АГ-АТ. При люмінесцентному мікроскопічному дослідженні в тій ділянці, де локалізуються комплекси АГ-АТ, виявляють флюоресценцію мітки (рис.34).

компоненти непрямий РИФ, призначеної для експреесс-діагностики грипу А:

1) досліджуваний матеріал змив з носоглотки хворого з підозрою на грип;

2) специфічна антисироватка з антитілами проти вірусу грипу А;

3) антиглобулінова сироватка (АТ проти імуноглобуліну), мічена флюорохромом;

4) ізотонічний розчин хлориду натрію.

Мазок з досліджуваного матеріалу спочатку обробляють імунною сироваткою до шуканого антигену, а потім - меченной антіглобуліновой сироваткою.

Імунні комплекси АГ-АТ - мічені АТ виявляються за допомогою люмінесцентного мікроскопа.

Перевага непрямого методу полягає в тому, що немає необхідності приготування широкого набору флюоресцирующих специфічних сироваток, а застосовується лише одна флюоресцирующая антиглобулінова сироватка.

для серологічної діагностики грипу А,тобто для визначення антитіл проти вірусу грипу А в сироватці крові за допомогою непрямий РИФвикористовують грипозний диагностикум (антиген вірусу грипу А). Серодиагностика вірусних інфекцій в основному носить ретроспективний характер і застосовується для підтвердження діагнозу і епідеміологічного аналізу.

Імуноферментний аналіз (ІФА): конкуретного спосіб (визначення HBs-АГ вірусу гепатиту В) і непрямий спосіб (серологічна діагностика ВІЛ - інфекції)

Імуноферментний аналіз (ІФА)

В якості мітки використовуються ферменти: пероксидаза, лужна фосфатаза та ін.

Індикатором реакції є здатність ферментів викликати кольорові реакції при дії на відповідний субстрат. Наприклад, субстратом для пероксидази є розчин ортофенілдіаміна (ОФД) або тетраметилбензидин (ТМБ).

Найбільш широко застосовується твердофазний ІФА (рис.35), непрямий і конкурентні способи (рис.36).

Результати ІФА можна оцінити візуально і вимірюванням оптичної щільності на спектрофотометрі (ІФА - аналізаторі).

До переваг ІФА слід віднести:

Простота методів оцінки реакції;

Стабільність кон'югатів;

Легко піддається автоматизації.

Як приклади наводяться наступні типи ІФА:

А) конкурентний тип

Призначений для виявлення поверхневого антигену вірусу гепатиту В (HBs Ag) в сироватках і плазмі крові при діагностики вірусного гепатиту В і визначення носійства HBs Ag.

компоненти:

1) досліджуваний матеріал - сироватка або плазма крові;

2) антитіла до HBs Ag, адсорбовані на поверхні лунки полістиролу мікропланшетів;

3) кон'югат - мишачі моноклональні антитіла до HBs Ag, мічені пероксидазою;

4) ортофенілендіамін (ОФД) - субстрат;

5) фосфатно - сольовий буфер;

6) контрольні сироватки:

Позитивна (сироватка з HBs Ag);

Негативна (сироватка без HBs Ag).

Хід роботи:

2. Інкубація 1 годину при 37 ° С.

3. Відмивання лунок.

4. Внесення кон'югату.

5. Інкубація 1 годину при 37 ° С.

6. Відмивання лунок.

7. Внесення ОФД. При наявності HBs Ag розчин в лунках жовтіє.

8. Облік ІФА проводять по оптичної щільності за допомогою фотометра. Ступінь оптичної щільності буде обернено пропорційною концентрації досліджуваних HBs Ag.

Реакція протікає в три фази:

1. HBs Ag досліджуваної сироватки (плазми) зв'язується з гомологічними АТ, адсорбованими на поверхні лунки. Утворюється ІК АГ-АТ. (HBs Ag - anti HBs АТ).

2. Антитіла до HBs Ag, мічені пероксидазою зв'язуються з рештою вільними детермінантомі HBs Ag комплексу АГ-АТ. Утворюється комплекс АТ-АГ-мічені АТ (anti HBs АТ - HBs Ag - anti HBs АТ, мічені пероксидазою).

3. ОФД взаємодіють з пероксидазою комплексу АТ-АГ-АТ і відбувається жовте забарвлення.

В) непрямий тип

Є основною тестової реакцією діагностики ВІЛ - інфекції.

Мета: Серологічна діагностика ВІЛ-інфекції - виявлення антитіл до антигенів ВІЛ.

компоненти:

1) досліджуваний матеріал - сироватка крові (АТ до АГ-м ВІЛ);

2) синтетичні пептиди імітують 2-х антигенів ВІЛ: gp 120 і gр 41, адсорбовані на поверхні полистироловой лунки;

3) антиглобулінова сироватка, мічена пероксидазою, отримана шляхом імунізації кроликів глобулинами людини (АТ до АТ);

5) фосфатно-сольовий буфер;

6) контрольні сироватки:

позитивна;

Негативна.

Хід роботи:

1. Внесення контрольних та досліджуваних сироваток.

2. Інкубація 30 хвилин при 37 ° С.

3. Відмивання.

4. Внесення антіглобуліновой сироватки міченої ферментом.

5. Інкубація 30 хвилин при 37 ° С.

6. Відмивання.

7. Внесення ОФД.

Реакція протікає в 3 фази:

1. Антитіла до ВІЛ досліджуваної сироватки зв'язуються з гомологічними антигенами (gр 120 і gр 41), і на поверхні сорбенту утворюється ІК АГ-АТ (АГ ВІЛ - АТ до ВІЛ).

2. Освіта ІК АГ-АТ-АТ, мічене пероксидазою, тому що АТ досліджуваної сироватки є антигенами для антіглобуліновой сироватки.

3. ОФД взаємодіє з пероксидазою комплексу АГ-АТ-АТ, і відбувається жовте забарвлення розчину лунки. Ступінь ферментативної активності прямо пропорційна концентрації досліджуваних АТ.