Визначення фагоцитарної активності клітин крові. Методи визначення фагоцитарної активності

Принцип способу.Деякі клітини білої крові (гранулоцити та меншою мірою моноцити) здатні in vitro і in vivo поглинати, а часто й руйнувати чужорідні частинки за допомогою своїх ферментів. Причому процес проходить кілька стадій, які включають хемотаксис, фагоцитоз, руйнування мікробів і перетравлення поглинених речовин. При повторному контакті чи специфічної імунізації клітини опсонуються, т. е. ця здатність посилюється. Розроблено велике числометодик визначення фагоцитарної активності клітин крові Для цього використовують певну тест-систему (конкретний вид бактерій, зимозан). В одних випадках реакцію проводять у пробірках чи чашках Петрі на агарі, а в інших – усередині організму тварини (внутрішньосудинно, інтраперитенально або методом «віконця рога»).
Хід визначення.
1. Приготування тест-системи: мікробна завись із вмістом 1-2 млрд тіл в 1 мл за оптичним стандартом.
2. Змішування 2%-ного розчину лимоннокислого натрію, крові та мікробної суспензії у співвідношенні 1:2:1 та термостатування 30 хв при температурі 40,5 °С.
3. Центрифугування при 1500 об/мні 10 хв і приготування мазків на предметному склі з верхнього шару осаду і на агарі в чашках Петрі.
4. Фіксація препаратів метиловим спиртом протягом 3-5 хв та забарвлення за Романовським - Гімза протягом 10-15 хв.
5. Облік реакції. У пофарбованих мазках під мікроскопом (збільшіть 90x7) підраховують 100 нейтрофілів або моноцитів, що містять мікробів або ні, враховуючи кількість мікробів у клітині і ступінь їх забарвлення (перетравлення). Вираховують відсоток фагоцитованих клітин - показник активності, і середня кількість мікробів на один фагоцит - фагоцитарний індекс; відношення числа переварених мікробів до загальному числуфагоцитованих клітин дає відсоток перетравлення, а середнє їхнє число на один фагоцит дає індекс перетравлення.
Для кількісної оцінки здатності фагоцитів, що перетравлює, введено поняття індексу завершеності фагоцитозу. Для цього визначають відношення відсотка фагоцитозу, отриманого через 30 хв інкубації, до відсотка фагоцитозу через 2 години та відношення фагоцитарних індексів. Прийнято вважати, що й індекс завершеності фагоцитозу більше 1, то фагоцитоз завершений, якщо менше - незавершений. Для оцінки ступеня підвищення фагоцитозної активності лейкоцитів при специфічній імунізації вираховують опсонофагоцитарний індекс фагоцитарних чисел у імунізованих і контрольних тварин. У новонароджених тварин доцільно обчислити елімінуючу здатність лейкоцитів крові по абсолютним показником.

Дослідження фагоцитарної активності лейкоцитів – аналіз крові, який спрямований на визначення резервних можливостей нейтрофілів та моноцитів до виконання їх основної функції – поглинання та переробки чужорідних агентів. Тест виконується у комплексі імунограми. Він показаний пацієнтам з рецидивуючими та хронічними інфекціями, набутими та генетичними імунодефіцитними станами, аутоімунними та онкологічними захворюваннями, що перенесли складні операції, у тому числі щодо трансплантації органів. Аналізу піддається цілісна кров. Дослідження ґрунтується на оцінці фагоцитозу бактерій з флуоресцентними мітками. У нормі фагоцитуючі гранулоцити становлять від 82% до 90% від загальної кількості, фагоцитуючі моноцити – від 75% до 85%. Готовність результатів – до 8 днів.

Фагоцитарна активність лейкоцитів – лабораторний показник, який відображає відсоток нейтрофілів та моноцитів, здатних до зв'язування з патогенною мікрофлорою та її перетравлення. Фагоцити – клітини, що захищають організм від розвитку інфекцій. Вони вважаються компонентом вродженого імунітету, у крові представлені двома видами лейкоцитів – моноцитами та нейтрофілами. Моноцити є великими клітинами макрофагами. Вони мають виражену здатність до поглинання, переробляють великі за розмірами клітини і органічні сполуки. У місці запалення вони фагоцитують бактерії, лейкоцитарну масу, уражені клітини. В результаті тканини очищаються та готуються до регенерації. Нейтрофіли відносяться до мікрофагів, на відміну від моноцитів поглинають лише невеликі клітини та органічні компоненти. Після переробки агентів нейтрофіли гинуть, вивільняють речовини, які ушкоджують бактерії та грибки, посилюють приплив імунних клітин до осередку запалення.

Аналіз крові на фагоцитарну активність лейкоцитів дозволяє оцінити резерв моноцитів та нейтрофілів до перетравлення чужорідних агентів. Зміна характеристик фагоцитів відображає не тільки імунологічну реактивність організму, але й особливості деяких інших процесів – білкового та вуглеводного обміну, наявність інтоксикації та виснаження організму, активність відновлення після захворювань тощо. та у ревматології, онкології, хірургії. Результати дослідження відображаються як відсоток активних фагоцитів до їх загальної кількості. Виявлення активних нейтрофілів та моноцитів проводиться за допомогою бактерій з флуоресцентними мітками. Біоматеріалом для дослідження є цільна кров із гепарином.

Показання

Дослідження фагоцитарної активності лейкоцитів показано за підозри на вроджений чи набутий імунодефіцит. Воно призначається при затяжних, хронічних та рецидивуючих інфекційних захворюваннях – характерною ознакоюзниження імунітету. Найчастіше на аналіз спрямовуються пацієнти з пневмонією, синуситом, отитом, ентероколітом, кандидозом, циститом. Також про недостатність імунного захисту можуть свідчити рани, що тривало не гояться, ускладнення після операцій. Тому аналіз виконується при підготовці до хірургічного втручання та при ускладненій течії післяопераційного періоду, при тривалому відновленні після травм та опіків. До інших показань для даного дослідження відносяться алергічні, аутоімунні та онкологічне захворювання. Результати дозволяють оцінити активність імунного захисту (фагоцитозу) та її роль у розвитку хвороби.

Аналіз крові на фагоцитарну активність лейкоцитів дозволяє визначити фактичну готовність організму до протистояння інфекціям. Однак варто пам'ятати, що цей показник змінюється під впливом багатьох факторів. Так, активність моноцитів та нейтрофілів знижується після фізичного навантаження та при розумовій втомі, а після прийому калорійної їжі підвищується. Ще одним обмеженням аналізу і те, що процедура дослідження займає до 8 робочих днів, отримані результати відбивають стан тижневої давності.

Підготовка до аналізу та забір матеріалу

Для дослідження фагоцитарної активності лейкоцитів проводиться забір крові із вени. За день до аналізу слід виключити з раціону алкоголь, скасувати спортивні тренування та інші інтенсивні фізичні навантаження, уникати стресових ситуацій. Також необхідно проконсультуватися з лікарем про вплив ліків на результат дослідження, можливо, деякі препарати будуть тимчасово скасовані. Процедура забору крові, як правило, проводиться з ранку, після нічного періоду голодування або через 4 години після їди.

Кров береться з ліктьової вени з допомогою пункції, на дослідження фагоцитарної активності лейкоцитів найчастіше використовується метод оцінки фагоцитозу бактерій з флуоресцентною міткою. З крові шляхом центрифугування та відмивання виділяють моноцити та нейтрофіли – досліджуваний матеріал. Потім зразок вводять культуру люмінесцентних бактерій, суміш ресуспендують і інкубують, за інтенсивністю люмінесценції визначають кількість лейкоцитів, що фагоцитували бактерії. Результати аналізу готуються протягом 7-8 робочих днів. Фагоцитарна активність моноцитів і нейтрофілів може бути визначена й іншими методами, наприклад, фарбуванням клітин, що фагоцитували (метод Романовського-Гімзи), за активністю лізосомальних ферментів, виробництва цитокінів, присутності катіонних білків.

Нормальні значення

Результат аналізу крові на фагоцитарну активність лейкоцитів виражається у відсотках фагоцитуючих клітин від їх загальної кількості. Значення норми гранулоцитів – від 82 до 90%, для моноцитів – від 75 до 85%. Ці показники однакові для пацієнтів різного віку та обох статей. Фізіологічне зниження фагоцитозу може визначатися під час вагітності, після фізичного навантаження, що не відповідає рівню підготовки, та після емоційного стресу.

Підвищення та зниження показника

Підвищення фагоцитарної активності лейкоцитів немає діагностичної значущості, причиною можуть стати гострі інфекції. Активність моноцитів та нейтрофілів збільшується щодо вихідного рівня.

Аналіз фагоцитарної активності лейкоцитів відноситься до імунологічних методів дослідження. Його показники дозволяють визначити резервні здібності клітин крові до поглинання та перетравлення інфекційних агентів, тобто готовність організму протистояти розвитку захворювання. Якщо результати аналізу нижче норми, необхідно проконсультуватися з лікарем – імунологом, інфекціоністом, хірургом, ревматологом, онкологом. Фізіологічне зниження показників можна скоригувати правильним підбором фізичного навантаження, профілактикою стресу.

www.krasotaimedicina.ru

Лікар імунолог-алерголог Болібок Володимир Анатолійович

Антитіла чи імуноглобуліни. Імуноглобуліни є досить великими і складними молекулами білків, які синтезуються клітинами імунної системи– плазматичними клітинами. У свою чергу, плазматичні клітини походять із B-лімфоцитів. Імуноглобуліни мають властивість зв'язуватися з чужорідними молекулами (білками, ліпопротеїдами), що знаходяться як у розчиненому стані, так і на поверхні вірусів, бактерій тощо. Чужорідні молекули можуть бути і на мембрані власних клітин, якщо ці клітини інфіковані вірусами чи мутировали. Антитіла самі по собі не можуть вбити вірус, бактерію чи клітину, або хімічно зруйнувати токсин, що виділяється бактеріями. Але можуть, по-перше, їх нейтралізувати, порушити функцію чи зняти токсичність; по-друге, «вказують» імунній системі на «чужинця», якого слід знищити. Після того, як антитіла прореагували з чужорідними молекулами на поверхні вірусів, бактерій та ін об'єктів, в бій з ними вступають білки системи комплементу, цитотоксичні Т-лімфоцити або клітини-фагоцити (нейтрофіли та моноцити-макрофаги). При цьому зв'язування антитіл дуже вибіркове - один вид антитіл реагує тільки з чужорідною молекулою, проти якої він виробляється. Ця властивість називається специфічністю антитіл. Наприклад, антитіла проти вірусу кору не реагують із вірусом вітряної віспи, і навпаки.

за хімічної будовиімуноглобуліни поділяються на 5 класів:

Імуноглобуліни класу G. Це основний клас захисних антитіл, що становить понад 80% всіх антитіл, що циркулюють у крові та у внутрішньому середовищі організму. Імуноглобуліни класу G починають вироблятися приблизно через 7 – 10 днів після першого контакту з незнайомою інфекцією та їх рівень наростає до максимуму приблизно на 30 – 40 день. Імуноглобуліни класу G довго зберігаються в крові, іноді їх синтез триває роками та десятиліттями, і саме вони забезпечують набутий імунітет до більшості інфекцій, як після захворювання, так і після вакцинації. Імуноглобуліни класу G можуть проникати через плаценту до дитині, що розвиваєтьсяі накопичуватись у крові дитини перед народженням. У цьому вся є глибокий сенс, т.к. дитина з материнськими антитілами набуває і імунітету проти тих інфекцій, з якими контактує мати у своєму звичайному оточенні.

Імуноглобуліни класу M. Це найбільші антитіла, і вони виробляються в першу чергу при контакті з незнайомою інфекцією. Імуноглобуліни класу M з'являються протягом першої доби від початку інфекції, помітний рівень створюється вже до 3 – 4 дня, максимум – на 7 – 10 день, а потім, після знищення інфекції в організмі, вони швидко зникають – приблизно через 4 – 6 тижнів. Імуноглобуліни класу M не проникають через плаценту.

Імуноглобуліни класу A. Ці так звані секреторні антитіла. Вони виділяються зі слизом через слизові оболонки в дихальні шляхи, по ходу шлунково-кишковий трактзі слізною рідиною на кон'юктиви, з потом і салом на шкіру. Основне призначення імуноглобулінів класу A – знищувати та блокувати інфекцію до того, як вона зможе проконтактувати з покривними тканинами організму та перешкоджати впровадженню інфекції всередину організму. Імуноглобуліни класу A не проходять через плаценту. Імуноглобуліни класу A у значних кількостях виділяються через молочні залози з грудним молоком(особливо висока концентрація IgA в молозиві), і оберігають слизові оболонки новонародженого та немовлявід інфекції

Імуноглобуліни класу D. Концентрація цих антитіл у крові також дуже низька – менше 1%. Імуноглобуліни класу D, на відміну від інших класів імуноглобулінів, синтезуються не плазматичними клітинами, а самими лімфоцитами, і є злущені рецептори з поверхні зовнішньої мембрани лімфоцитів, по суті – це уламки мембрани загиблих лімфоцитів. Клінічне значення цих імуноглобулінів досі не з'ясовано, тому їх рівень зазвичай не перевіряють.

Білки системи комплементу.

Антитіла або імуноглобуліни, як сказано вище, здатні зв'язуватися з вірусами та бактеріями, але не здатні їх вбивати. Здатність вбивати бактерії, грибки та інші клітини має білки системи комплементу. У системі комплементу налічують 9 основних та 2 додаткових білка, всі вони знаходяться в крові і готові негайно слідом за антитілами атакувати «чужинців». Ці білки відносяться до білків-ферментів, а саме до протеазів. Білки системи комплементу здатні, взаємодіючи між собою, збиратися в своєрідну «трубочку» або «голку», яка протикає оболонку вірусу, мікроба або власної інфікованої або чужорідної клітини, що стала, саме в тому місці, де прореагували антитіла. Ця «голка» зветься «мембранно-атакуючий комплекс». В результаті в оболонці клітини утворюється дірка. З огляду на те, що з мікробом може одночасно прореагувати понад 10000 молекул антитіл, у ньому одночасно утворюється така сама кількість «дірок» від білків. Під електронним мікроскопом поверхня клітини, яку атакують антитіла з комплементом, виглядає як місячний пейзаж, поритий кратерами від метеоритів. Оскільки концентрація солей усередині мікробної клітини вища, ніж зовні, вода через пори в мембрані спрямовується всередину мікробної клітини і мікроб у буквальному значенні лопається, роздутий водою. Відбувається лізис мікроба, яке останки поїдають фагоцити.

Комплемент – це зброя швидкого реагування. Білки системи комплементу вступають у реакцію негайно, як тільки антитіла виявлять чужинця. Це важливо для захисту від інфекції в ранах - якщо активність комплементу в організмі висока, то інфекція, що потрапила в рану, буде знищена практично моментально, і рана (захищена від подальшого інфікування струпом з крові, що згорнулася) не нагноиться.

Лізоцим.

В організмі виробляються спеціальні ферменти, здатні розчиняти оболонку бактерій, їх найбільш вивчений – лизоцим (мурамилпептидаза). При розчиненні оболонки лізоцим мікроб втрачає свої патогенні властивості, не може далі інфікувати організм і стає легшою мішенню для антитіл і комплементу і легшою «їжею» для фагоцитів.

Інтерферони.

Це особлива група білків, яку виробляють як клітинами імунної системи (лейкоцитами), так і іншими клітинами організму, найчастіше епітеліальними, якщо вони інфіковані яким-небудь вірусом. Інтерферони захищають будь-які інші клітини організму від інфікування вірусом. Інакше будь-яка вірусна інфекція призводила до того, що інфікованими ставали всі клітини організму.

C-реактивний білок.

Цей білок присутній у крові в дуже незначній кількості, але його кількість збільшується в десятки та сотні разів при появі вогнища бактеріального запалення. Тому С-реактивний білок (читається Ц) відноситься до білків "гострої фази". СРБ здатний пов'язувати і «склеювати» між собою оболонки бактерій: у процесі розмноження мікроби залишаються склеєними між собою та утворюють великий конгломерат із мікробних клітин. По-перше, це не дає мікробам розноситися зі струмом крові та лімфи по організму. По-друге, всередині такої «колонії» мікроби не отримують достатньої кількості поживних речовин та їх зростання та розмноження сповільнюється чи зупиняється зовсім. По-третє, на налиплий на оболонці мікробів С-реактивний білок фагоцити реагують підвищеною активністю і починають поглинати ці мікроби з більшою жадібністю.

doctor-bolibok.narod.ru

Фагоцитарна активність нейтрофілів

Фагоцитарну функцію клітин периферичної крові прийнято оцінювати по відсотку фагоцитуючих нейтрофілів в кількість 1,0 мм. Іншими словами, абсолютний фагоцитарний показник – це кількість мікробів, які здатні поглинути нейтрофіли, що містяться в 1 мм3 крові. При постановці реакцій фагоцитозу використовують завись убитих мікроорганізмів і кров хворого. Після інкубації крові та бактерій у термостаті готують мазки, забарвлюють їх та оцінюють поглинальну здатність гранулоцитів.

Для постановки реакції фагоцитозу використовують також завись живих мікроорганізмів. У цих випадках фагоцитарна активність гранулоцитів буде в 2 - 2; 5 рази нижче, ніж у реакціях з убитими бактеріями. Розеткоутворюючі властивості нейтрофілів. У Останніми рокамиз'ясовано, що нейтрофіли людини мають на поверхні своєї мембрани рецептори до ряду компонентів комплементу та Fc-фрагментів імуноглобулінів. Встановлено також наявність на мембрані нейтрофілів рецепторів до еритроцитів барана.

Як і лімфоцити, нейтрофіли можуть бути розділені на популяції за їх здатністю до спонтанного розеткоутворення з еритроцитами барана і комплементарного розеткоутворення з алогенними еритроцитами в присутності комплементу та імуноглобулінів.

Постановка реакцій спонтанного та комплементарного розеткоутворення нейтрофілів аналогічна постановці реакцій спонтанного та комплементарного розеткоутворення лімфоцитів. Комплементарна активність сироватки. Компоненти комплементу біологічно інертні, але при активації комплексом антиген - антитіло набувають властивостей ензимів та відіграють виражену (захисну або деструктивну) роль в імунному цитолізі. Крім цитолізу, комплемент безпосередньо бере участь у різних проявах неспецифічного захисту організму і головним чином різних фазах запальної реакції, як клітинної, і гуморальної.

Серед цих проявів найбільш вивчена активність комплементу, що призводить до вивільнення гістаміну та підвищення проникності капілярів, керуюча хемотаксисом і підвищує фагоцитуючу здатність нейтрофільних гранулоцитів, що сприяє імунному прилипання та опсонізації фагоцитуючих частинок, порушення клітинної стінки.

Підвищуючи проникність дрібних кровоносних судин, комплемент, очевидно, бере участь у управлінні міграцією гранулоцитів.

Система комплементу представлена ​​білковими молекулами, які локалізуються в альфа- та бета-глобулінових фракціях і складається з 11 білків сироватки крові, що становлять 9 компонентів.

Для активації системи комплементу необхідні спеціальні субстанції, внаслідок впливу яких компоненти комплементу активують один одного у строгій послідовності (каскадне або секвенційне включення) двома шляхами - класичним та альтернативним (або пропердиновим).

Активація класичного шляху викликається комплексом антиген - антитіло, агрегованим імуноглобулінами класів G і М, або комплексами поліаніон - полікатіон, таким, наприклад, як гепарин-протаміновий комплекс. При цьому перший компонент комплементу (С1) утворює С1-естеразу, яка розщеплює четвертий (С4) та другий (С2) компоненти комплементу, сприяючи утворенню СЗ-конвертази класичного шляху.

Альтернативний шлях активації комплементу є еволюційно давнішим. Він найбільш важливий в антибактеріальному захисному механізмі, перш ніж почнуть вироблятися специфічні антитіла. Активація альтернативним шляхом викликається агрегованими імуноглобулінами класів А та Е, розчинними та нерозчинними полісахаридами оболонок бактерій і не вимагає наявності С1-, С4- та С2-компонентів комплементу.

У першій стадії лежить на поверхні активатора утворюється ензим як наслідок взаємодії чинників компонента СЗ. Ензим дуже лабільний, але здатний розщеплювати СЗ і таким чином сприяти утворенню ефективнішої СЗ-конвертази. Утворення СЗ-конвертази та розщеплення під її впливом третього компонента комплементу є вузловими моментами обох шляхів активації.

На цій стадії відбуваються комплементзалежні клітинні взаємодії. Так звані комплементарні мости беруть участь в індукції імунних відповідей, елімінації імунних комплексів та контролі бактеріальних інфекцій. Утворення таких мостів тривалий час було відоме як імунне прилипання.

Цей феномен використовується у тесті комплементарного розеткоутворення. Обидва шляхи активації комплементу ведуть до генерації біологічно активних фрагментів компонентів комплементу. Так, система комплементу активується агентами, які постійно присутні в нормально функціонуючому організмі.

У процесі еволюції розвинулися механізми контролю її активації. Існують два основні механізми регулювання активації комплементу. Перший притаманний самій системі і полягає у лабільності СЗ-конвертази обох шляхів, що лімітує активацію наступних компонентів комплементу, що беруть участь у каскадному включенні активації (С5 - С9).

Другий здійснюється спеціальними природними білками-інгібіторами. З них найбільш важливі С1-інгібітор, який утворює комплекс із фрагментом С2, не даючи йому далі розщеплювати С4 та С2, і таким чином контролює складання СЗ-конвертази класичного шляху, та СЗ-інактиватор, який служить основним контрольним білком системи комплементу, розщеплюючи СЗ у рідкій фазі на два гемолітично неактивні білки.

Є дані про зміни в системі комплементу за різних патологічних станах. Так, Kassel (1977) у більш ніж 5000 хворих на рак різної локалізаціївстановив дефіцит комплементу та його компонентів.

Окремі компоненти сироваткового комплементу зазвичай визначають методом радіальної імунодифузії по Манчіні з використанням моноспецифічних антисироваток до того чи іншого компонента. Активність комплементу оцінюють також за його здатністю лізувати еритроцити у присутності антитіл проти них.

За одиницю гемолітичної активності комплементу приймають активність, необхідну для лізису 50% еритроцитів у присутності антитіл. Використовуючи метод кінетичного титрування, реакцію можна записати у часі. Ця реакція якісна і не дає уявлення про концентрації комплементу та його компонентів.

«Корекція імунітету у хворих на рак

передміхурової залози», В.А.Савінов

www.medchitalka.ru

Фагоцитарна активність лейкоцитів периферичної крові у різних видів тварин

ОСОБЛИВОСТІ ФОРМУВАННЯ РОЗЦЕНОК НА ВЕТЕРИНАРНІ ПОСЛУГИ ПРИ ОБСЛУГОВУВАННІ ДРІБНИХ ДОМАШНІХ ТВАРИН

Трофімова Є.М.

Врахування особливостей формування розцінок на ветеринарні послуги при обслуговуванні дрібних домашніх тварин забезпечує встановлення науково - обґрунтованих розцінок, що використовуються у ветеринарній практиці.

FEATURES OF FORMATION OF QUOTATIONS ON VETERINARY SERVICES AT

SERVICE OF SMALL PETS

Нарахунку особливостей формування quotations on veterinary services at service of male pets provides establishment scientifically - well-founded quotations which are used in veterinary practice.

УДК 619:616 - 002.5

ФАГОЦИТАРНА АКТИВНІСТЬ ЛЕЙКОЦИТІВ ПЕРИФЕРИЧНОЇ КРОВІ У РІЗНИХ ВИДІВ ТВАРИН

Трубкін А.І., Харитонов М.В.

ФГЗУ ВПО «Казанська державна академія ветеринарної медицини імені Н.Е. Баумана»

Ключові слова: мікобактерія, штам, фагоцитарна активність.

Key words: mycobacterium, strain, phagocytic activity.

Кров є одним з найбільш тонких і чутливих показників, що вказують на функціональний стан організму, що відображають картину боротьби його з мікроорганізмами, що впровадилися, гельмінтами та його реактивну здатність. Розроблена І.І. Мечниковим теорія захисної ролі фагоцитів у боротьбі організму з патогенними мікробами, що впровадився в його тканині, стала першим кроком до побудови теорії протиінфекційного імунітету. За даними літературних джерел, фагоцитоз при туберкульозній інфекції має неспецифічний захисний характер. Однак є ряд спостережень, які свідчать про те, що певний ступінь специфічності у фагоцитарних реакціях при туберкульозі є. Наприклад,

А.Д. Тимофіївський, С.В. Білеволенська (1927), Г.Д. Бєлановський (1928) показали, що фагоцитуючі клітини перитоніального ексудату, периферичної крові, селезінки та легені, імунізованих та природно резистентних тварин не руйнуються в присутності вірулентних мікобактерій, а навпаки, пригнічують їх розмноження.

Ще більш складним є питання про долю самих туберкульозних мікобактерій, що проникають в організм, і реакції, яку вони викликають в органах. За літературними джерелами (А.С. Рабухін, 1941; Ю.А. Лебедєва, С.М. Сажина, 1913 та ін.) у присутності вірулентної туберкульозної культури спочатку відбувається нейтрофільний лейкоцитоз і фагоцитоз туберкульозних мікобактерій нейтрофільними лейкоцитами, наповнених збудником. При цьому лейкоцити від хворих на неспецифічні захворювання легень, з обмеженою формою туберкульозу, у випадках інфікування малими дозами туберкульозних паличок відбувається посилений перехід їх у лімфобласти. У той же час лейкоцити страждають хронічними або гострим перебігом туберкульозу піддаються швидкому розпаду.

У зв'язку з цим, певний інтерес викликало порівняльне вивчення фагоцитарної активності лейкоцитів периферичної крові у різних видівтварин, у тому числі у морських свинок та кроликів.

Матеріали та методи. Використовували лейкоцити периферичної крові здорових тварин: велику рогату худобу, коні, вівці, кози, собаки, кролика, морської свинки, білого щура.

Щоб кров не згорнулася, її гепаринізували з розрахунку 4 од. ін'єкційного гепарину на 1 мл крові. Після попереднього перемішування пробірки з кров'ю протягом 1 години залишали під кутом 100 при кімнатній температурі. Потім пробірки ставили під кутом 450 протягом 15-20 хв. при цьому необхідна кількість лейкоцитів для постановки дослідів накопичується між еритроцитами та плазмою у вигляді туману. Лейкоцити, що накопичилися, відсмоктували і вносили у флакони з вмістом по 5 мл середовища 199. Після легкого перемішування отриманої суміші, у флакони вносили M. bovis штаму N14 культури мікобактерій по стандартній каламутності 1 мг в 1 мл фізіологічного розчину.

Флакони закривали гумовою пробкою і після легкого перемішування у вертикальному положенні помістили термостат при температурі 370С.

Спочатку через кожні 15 хв. (15,30,45,60,75,90,105,120хв), а потім через3,4,5,6,24,48 і 72 год. з моменту інкубації робили мазки за допомогою спеціально виготовленого для цієї мети скла під кутом 200. фіксували у насиченому розчині дволористої ртуті 2-3 хв. і фарбували карболовим фуксином Циля, знебарвлювали 2,5% - ним розчином сірчаної кислоти. Для розчинення еритроцитів додатково

обробляли розчином оцтової кислоти і додаткового фарбування 0,5% - ним розчином метиленової синьки, змішаної з 0,5% - ним розчином соди.

Підраховували 100 поліморфних ядерних лейкоцитів, по 50 одиниць з кожного краю мазка, і виводили фагоцитарну активність лейкоцитів у відсотках.

Фагоцитарний показник визначили наступним чином, підраховували кількість фагоцитованих туберкульозних паличок у 100 лейкоцитах та отриману кількість ділили на кількість переглянутих лейкоцитів.

Результати досліджень. Вивчення фагоцитарної активності лейкоцитів периферичної крові у різних видів тварин по відношенню до вірулентних культур мікобактерій туберкульозу бичачого виду показало, що в перші 15 хв. після контакту лейкоцитів відбувається накопичення мікробних тіл навколо клітин, що фагоцитуються крові (атракція), але при цьому ще не спостерігали поглинання мікробних тіл. Через 30 хв., після введення мікобактерій виявлялося підвищення фагоцитарної активності лейкоцитів по відношенню до мікобактерій у всіх видів тварин. Як видно з таблиці 1, у перші 30 хв. значну фагоцитарну активність виявляють лейкоцити білого щура (9,2±2,03%; Р

У продуктивних тварин висока фагоцитарна активність лейкоцитів спостерігалася у кози 6,2±2,10% (Р

Одночасно з фагоцитарною активністю лейкоцитів було вивчено фагоцитарний показник, - кількість фагоцьованих мікробів у 100 лейкоцитах. Дані, що показують середнє число поглинених мікобактерій на один фагоцит представлені в таблиці 2. причому, для обліку інтенсивності фагоцитозу всі лейкоцити, що фагоцитували, розбивали на три групи: в першу входили клітини, що містять від 1 до 10 мікобактерій; у разі такі клітини становили 80%; у другу -от10 до 20, такі клітини, становили 15%; у третю - понад 20 мікобактерій, такі клітини становили 5%, з усіх підрахованих клітин.

Як видно з таблиці, початковий фагоцитарний показник щодо вірулентної культури мікобактерій бичачого виду у всіх тварин був нижчим за одиницю.

* 15 30 45 60 75 90 105 120 3 ч. 4 ч. 5 ч. 6 ч. 24 ч. 48 ч. 72 год.

1. Кінь 3 6,8 ± 1,62 3,5 ± 0,95 4,3 ± 1,10 5,8 ± 1,31 6,4 ± 1,68 8,7 ± 1,62 10,0 ± 2,71 18,5 ± 4,00 25,0 ± 3,10 28,6 ± 3,80 30,0 ± 3,22 39,0 ± 3,50 43,9 ± 7,72 48,4 ± 6 ,20 48,7 ± 5,20

2. Кр. ріг. худоба 3 5,0 ± 1,03 3,4 ± 0,93 4,8 ± 1,19 5,8 ± 1,14 5,8 ± 1,39 7,4 ± 2,31 12,2 ± 2, 96 19,0 ± 3,43 26,1 ± 3,31 27,6 ± 5,19 38,8 ± 6,05 40,0 ± 6,15 41,6 ± 8,07 43,0 ± 8,11 43,2±5,08

3. Вівця 3 5,6 ± 1,11 0,05 4,8 ± 1,05 0,05 6,2 ± 1,21 9,2 ± 2,05 12,4 ± 3,63 15,8 ± 2 ,33 19,8 ± 2,91 24,2 ± 3,81 30,0 ± 4,01 33,8 ± 4,17 38,8 ± 5,26 40,0 ± 4,15 44,8 ± 5, 17 49,6 ± 5,09 51,8 ± 7,11

4. Коза 3 6,4 ± 2,09 6,2 ± 2,10 7,8 ± 2,20 9,2 ± 2,81 11,0 ± 2,33 19,4 ± 3,17 23,0 ± 3,19 25,4 ± 4,21 35,8 ± 6,15 37,0 ± 5,11 40,0 ± 5,08 44,4 ± 5,19 52,0 ± 7,01 55,6 ± 7 ,12 60,4 ± 7,07

5. Собака 3 6,6 ± 1,15 7,8 ± 2,03 9,2 ± 2,97 12,0 ± 3,53 12,8 ± 3,31 19,8 ± 3,03 26,1 ± 3,95 31,0 ± 3,91 38,4 ± 5,05 38,2 ± 4,17 40,4 ± 6,09 43,2 ± 6,12 49,5 ± 7,05 55,8 ± 8 ,11 67,0 ± 8,19

6. Кролик 3 4,3 ± 1,90 2,8 ± 0,9 3.1 ± 1.01 3,8 ± 1,56 3,9 ± 1,65 5,0 ± 1,68 5,4 ± 1,35 7 ,4 ± 2,06 7,8 ± 2,11 9,0 ± 2,19 12,6 ± 2,51 17,8 ± 3,19 0,05 24,4 ± 4,11 0,05 27,0 ± 4,92 31,0 ± 5,15 0,05

7. М. свинка 3 2,6 ± 1,07 1,2 ± 0,32 1,5 ± 0,95 2,0 ± 1,04 2,2 ± 1,00 2,8 ± 1,04 3, 4 ± 1,17 3,8 ± 1,23 4,1 ± 1,92 5.0 ± 2.00 5,6 ± 1,92 6.3 ± 2.03 11,8 ± 3,09 13,2 ± 3,19 17,2 ± 4,05

8. Білий щур 3 8,1 ± 1,35 9.2 ± 2.03 13,0 ± 2,20 19,6 ± 3,35 27,6 ± 5,49 31,6 ± 5,82 37,4 ± 6,05 43,8 ± 6,11 56,6 ± 7,14 59,8 ± 8,07 65,0 ± 8,15 72,3 ± 8,03 84,4 ± 8,15 87,0 ± 9,07 87 ,6 ± 9,19

* - атракція мікобактерій на поверхні лейкоцитів

№ п/п Вид тварин після контакту зі збудником через:

15 30 45 60 75 90 105 120 3 ч. 4 ч. 4 ч 5 ч. 6 ч. 24 ч. 48 ч. 72 год.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

1. Кінь 3 - 0,9±0,03 1,78±0,86 2,82±1,25 3,13±1,08 3,3±1,01 3.9±1.10 4,07±1,51 5,32±1,58 5,4±1,96 5,95±1,05 5,96±1,14 6,8±1,6 8,1±2,90 8,2±1,70

2. Кр. ріг. худоба 3 - 0,9 ± 0,02 1,5 ± 0,51 2,0 ± 0,52 2,2 ± 0,91 2,8 ± 0,85 3,1 ± 1,05 3,6 ± 1 ,21 4,0 ± 1,65 4,8 ± 1,12 5,2 ± 2,01 5,6 ± 2,12 5,4 ± 1,36 5,6 ± 2,05 5,6 ± 2, 17

3. Вівця 3 - 0,8±0,02 1,8±0,30 2,3±0,15 2,8±0,65 3,3±1,02 4,4±1,65 5,8 ± 2,01 5,8 ± 2,11 6,4 ± 3,03 6,0 ± 3,05 6,2 ± 3,18 6,0 ± 2,31 6,8 ± 2,15 6,8 ± 3,11

4. Коза 3 - 0,8 ± 0,11 1,7 ± 0,20 2,1 ± 0,80 2,3 ± 0,7 3,8 ± 1,05 4,0 ± 2,11 4,4 ± 2,01 5,1 ± 2,03 6,4 ± 2,11 6,8 ± 2,19 6,8 ± 2,35 7,6 ± 3,05 7,8 ± 3,12 7,8 ± 3,11

5. Собака 3 0,2 ± 0,01 0,8 ± 0,05 1,7 ± 0,15 2,3 ± 0,17 3,01 ± 1,01 4,5 ± 1,17 5,9 ± 1,19 6.5±2.05 7,2±2,01 7,5±2,10 7,8±2,05 8,7±3,15 9.5±3.05 9,9±3,41 10,1±3, 11

6. Кролик 3 0,3 ± 0,02 1,9 ± 0,3 1,9 ± 0,61 1,3 ± 0,85 2,0 ± 0,90 2,1 ± 0,80 2,6 ± 0,31 2,9 ± 0,68 2,9 ± 0,35 3,0 ± 1,05 3.0 ± 1.01 3,8 ± 1,15 3,9 ± 1,12 3,9 ± 1,05

7. М. свинка 3 - 0,1 ± 0,01 1,2 ± 0,3 1,6 ± 0,03 1,9 ± 0,2 1,1 ± 0,30 1,3 ± 0,9 1 ,3 ± 0,12 1,8 ± 0,75 1,9 ± 0,90 1,9 ± 0,85 2,0 ± 0,64 2,6 ± 1,01 2,6 ± 1,00 2, 7 ± 0,45

8. Білий щур 3 0,3 ± 0,1 0,9 ± 0,05 1,0 ± 0,04 2,8 ± 0,31 3,6 ± 1,15 5,3 ± 1,36 6,8 ± 2,02 7,5 ± 2,33 8,8 ± 2,14 9.0 ± 3.00 9,2 ± 3,06 9,1 ± 2,95 9,9 ± 2,12 10,0 ± 3,01 10 ,3±3,05

У міру терміну культивування клітин показник фагоцитозу достовірно (Р

ФАГОЦИТАРНА АКТИВНІСТЬ НЕЙТРОФІЛІВ КРОВІ ЛЮДИНИ У ГІПОТОНІЧНИХ СЕРЕДОВИЩАХ У ПРИСУТНІ АНТИБІОТИКІВ

PHAGOCYTIC ACTIVITY OF NEUTROPHILS HUMAN BLOOD IN HYPOTONIC MEDIUM BY ANTIBIOTIC ACTION

А.А. Міщенко, Е.М. Савельєва

A.A. Міщенко, Е.М. Савельєва

Досліджено фагоцитарну активність нейтрофілів крові людини в гіпотонічному середовищі та в присутності низки антибіотиків. Зниження тонічності у 1.5 -2.0 рази викликає збільшення параметрів фагоцитозу на 16%. У присутності фуросеміду дія гіпотонії не виявляється. Різні антибіотики викликають сильне пригнічення фагоцитозу.

Phagocytic reaction human neutrophils в hypotonic medium and at presence of antibiotics був investigated. Tonicity decrease of medium in 1.5 - 2 times causa increase of phagocytosis parameters на 16 %. На furosemide presence action of hypotonia is not shown. Різні антибіотики спричиняють сильну inhibition phagocytosis.

Ключові слова: нейтрофіл, фагоцитоз, фагоцитарна активність, гіпотонія.

Key words: neutrophil, phagocytosis, phagocytic activity, hypotonycity.

Вступ

Основним бар'єром на шляху проникнення інфекції в організм є слизові оболонки. Будучи багатокомпонентними системами, вони беруть участь у багатьох реакціях організму, зокрема імунних. У нормі в слизовій оболонці містяться імуноглобуліни та невелика кількість нейтрофілів та макрофагів. Саме ці клітини першими контактують з патогенами, у разі проникнення останніх у товщу тканин бар'єром стають лімфоїдні скупчення в товщі слизових.

Оскільки поверхні слизових оболонок не ізотонічні плазмі, для оцінки функціонування клітин імунної системи в таких умовах доцільно провести експерименти в анізотонічному середовищі in vitro. Так, показано, що у гіпотонічних розчинах у лейкоцитах активується кисневий вибух, метаболізм арахідонової кислотизбільшується концентрація іонів кальцію. У нашій роботі проведено дослідження фагоцитарної активності нейтрофілів крові під час моделювання гіпотонічних умов. Оскільки у випадку запального процесув організмі лікарями часто призначається антибіотична терапія, досліджено також дію антибіотиків різних класів на фагоцитарну активність нейтрофілів крові.

Об'єкти та методи

В експериментах використана венозна кров чоловіків донорів, отримана з Республіканської станції переливання крові (м. Сиктивкар). По 500 мкл крові поміщали у лунки планшета для імунологічних реакцій. У кожну лунку додавали суспензію дріжджових клітин (ТОВ «Саф-Нева»), попередньо відмитих тричі 0.9% розчином NaCl. Кількість дріжджових клітин у середньому становила 30 тис./1 мкл крові.

Для зниження тонічності в 2.0 та 1.5 рази на лунки додавали дистильовану воду (рН 7.4). У ряді експериментів у лунки з ізо- та гіпотонічними середовищами додавали також фуросемід у концентрації 1*10-5 Моль/л.

В експериментах з антибіотиками в лунки додавали лінкоміцин, цефтріаксон, амоксиклав та гентаміцин у концентрації 30 мг/л.

Проби інкубували у термостаті при 370°С протягом 20 хв. Потім планшет поміщали на лід для зупинки реакції фагоцитозу та з кожної лунки готували по 3 мазки. Після просушування та фіксації мазки забарвлювали Гімза-Романовським, переглядали під мікроскопом при імерсійному збільшенні 15*90.

Підраховували: 1) фагоцитарну активність – кількість активних нейтрофілів із 100 зустрінутих під час перегляду; 2) фагоцитарний індекс -середня кількість дріжджових клітин, поглинених одним нейтрофілом. Результати оброблені металом парних порівнянь, достовірність відмінностей між вибірками оцінювали за критерієм Вілкоксона.

Результати та обговорення

У контролі фагоцитарна активність лейкоцитів людської крові становила 49.5±5%, фагоцитарний індекс – 1.64±0.1(n=20). Дані узгоджуються з результатами, отриманими щодо фагоцитозу патогенної Candida crusei . Фагоцитарна активність нейтрофілів у цих умовах стимулюється Р-глюканами в клітинній стінці дріжджів, до яких на поверхні фагоцитів є рецептори, а також опсонізуючим ефектом компонентів системи комплементу C3bi та імуноглобулінів IgG, що є в плазмі крові.

При зниженні тонічності середовища в 1.5 та 2.0 рази (n=20) фагоцитарна активність збільшилась у середньому на 16.5%, склавши 58.1±9.1% (p<0.05). Увеличился также фагоцитарный индекс до 1.97±0.06 и 2.14±0.58 при снижении тоничности в 1.5 и 2.0 раза соответственно. Таким образом, гипотония вызвала активацию фагоцитоза, что отразилось в увеличении как доли активных клеток, так и скорости поглощения фагоцитами дрожжей. Одним из механизмов такого

дії гіпотонії може бути збільшення концентрації внутрішньоклітинного кальцію, внаслідок чого змінюється цитоскелет клітин, їх рухливість та фагоцитарна активність. Крім того, активність клітин у цих умовах може змінюватися в результаті запуску реакції регуляторного зменшення об'єму, RVD, у відповідь набухання клітин. З метою виключити вплив останнього було проведено інгібування фуросемідом K+,Cl" - котранспорту, активація якого призводить до RVD. Оскільки речовина змінює хемотаксичну активність клітин, попередньо було досліджено його вплив в ізотонічному середовищі. При цьому фуросемід не змінював фагоцитарну активність нейтрофілів (n= ), що узгоджується з опублікованими даними .На тлі гіпотонічного середовища фуросемід не змінював фагоцитарну активність у порівнянні з контролем і знижував її в порівнянні з результатами в гіпотонічному середовищі у відсутності речовини (p<0.05). В частности, в присутствии фуросемида фагоцитарная активность и фагоцитарный индекс составили 45.9±6.7%; 1.83±0.1 и 50.5±5.6%; 1.7±0.1 соответственно при

гіпотонії 1.5 та 2.0. Отже, блокуючи реакцію RVD, фуросемід тим самим запобігав активації клітин в умовах гіпотонії.

Під впливом антибіотиків показники фагоцитарної активності знизилися. За дії цефтріаксону фагоцитарна активність знизилася на 78% до 10±2.3 % (р<0.02), амоксиклав - на 70% до 17±3.9% (р<0.02), линкомицин - на 65% до 16±4.9% (р<0.02), гентамицин - на 76% до 11±3.6% (р<0.02). Фагоцитарный индекс в экспериментах с антибиотиками практически оставался неизменным, следовательно, данные препараты не влияют на скорость поглощения клеток.

Підвищення фагоцитарної активності під впливом антибіотиків зазначено у низці робіт. Згідно з іншими даними, фагоцитарна активність лейкоцитів пригнічується при дії таких антибіотиків, як ауреоміцин. Оксітстрациклін, еритроміцин, хлорамфенікол, поліміксин не викликають помітних змін фагоцитарної активності лейкоцитів.

Використані в дослідах антибіотики по дії належать до різних груп. Амоксиклав і цефтріаксон діють як бактерицидні препарати (пригнічують розвиток клітинної стінки, причому пригнічують синтез специфічного для клітинної стінки бактерій пептидоглікану - муреїну). Лінкоміцин та гентаміцин при низьких концентраціях діють як бактеріостатики та бактерицидно – при збільшенні концентрації (інгібують синтез білка за рахунок зв'язування з 50s та 30s субодиницями рибосоми). Усі антибіотики в наших експериментах справили інгібуючий ефект на нейтрофіли. Це може бути пов'язано із зміною структури

антибактеріальних препаратів внаслідок метаболічних процесів в організмі, внаслідок чого продукти метаболізму стають токсичними для

самих фагоцитів. Антибіотики є однією з головних причин нейтропенії та агранулоцитозу. Даний ефект справили пеніциліни, цефалоспорини та сульфаніламіди. Аміноглікозид гентаміцин збільшує утворення лізосом, що містять різні фактори вірулентності. Представники Р-лактамних антибіотиків, амоксиклав та цефтріаксон, можуть пригнічувати реакцію окисного вибуху.

Дані про дію лінкозамінів, до яких відноситься лінкоміцин, що використовується, на фагоцитарну активність суперечливі. При різних концентраціях препарату автори відзначають як підвищення фагоцитарної активності, і її зниження чи відсутність змін. Можливо, концентрація антибіотиків, що використовується в наших експериментах, була токсичною для клітин.

1. У контролі фагоцитарна активність та фагоцитарний індекс склали відповідно 49.5±5% та 1.64±0.1.

2. Заміна ізотонічного середовища на гіпотонічну викликає збільшення як фагоцитарної активності, так і фагоцитарного індексу відповідно на 16.5% та в 1.5-2 рази.

3. У присутності фуросеміду дія гіпотонії на фагоцитарну активність нейтрофілів не виявляється.

4. Антибіотики цефтріаксон, амоксиклав, лінкоміцин та гентаміцин викликають інгібування фагоциратної активності нейтрофілів на 78%, 76%, 65% та 70% відповідно.

1. Альошина О.М. Вивчення дії аморфного та кристалічного пені-цилінів на чумний мікроб // Тр. Ростовського-на-Дону ПЧІ. Ростов-на-Дону, 1959. Т. 15. Вип. 1. З. 153-160.

2. Ареф'єва Н.А., Азнабаєва Л.Ф. Імунні реакції слизової оболонки носа: цитологічна діагностика, методи лікування // Consilium Medicum. 2009. Т. 11. №11. З. 30-33.

3. Ізраельсон М.І., Шполянський Б.І., Боєвська Г.І. Вплив пеніциліну на функціональну здатність ретикуло-ендотеліальної системи та фагоцитарну активність лейкоцитів // Журн. мікро. епід. та імун. 1951. № 3. С. 59-62.

4. Лакін Г.Ф. Біометрія. М: Вища. школа, 1980. 291 с.

5. Фінкель Є.А., Луцька С.І. Автоакцинотерапія при туберкульозі: Монографія. Киргизстан, 1972. 154 с.

6. Bazzoni F., Cassatella M.A., Laudanna C., Rossi F. Phagocytosis ofpsonized yeast nduces tumor necrosis factor - alpha mRNA акумуляції і proteínу реакції з людським polymorphnonuclear leucocytes // J. Leukoc. Biol. 1991. V. 50. №3. P. 223-228.

7. Czop JK, Valiante NH, Janusz MJ. Phagocytosis particulate activators of human alternative complement pathway thought monocyte beta-glucan receptors // Prog. Biol. Res. 1989. V. 297. P. 287-296.

8. De Weck A.L. pharmacological and immunochemical mechanisms of drug hypersensitivity // Immunol Allergy Clin North Am. 1991. № 11. Р. 461-474.

9. Gilliland B.C. Drug-induced autoimmune and hematologic disorders // Immunol Allergy Clin North Am. 1991. № 11. Р. 525-553.

10. Hiura M., Ozawa M., Othsuka T. a. o. Стимуляція superoxide anion production в guinea pig поліморфонуклеїрних леукоцитів з гіпотонічною умовою з proteínом кінасу C activators // Arch. Biochem. Biophys. 1991. C. 15. № 291. P. 31-37.

11. Kishi K., Hirai K., Hiramatsu K., Yamasaki T., Nasu M. Clindamycin suppresses endotoxin був виконаний з ceftazidime-застосований Escherichia coli O55: B5 і subsequent production tumor necrosis factor alpha and interleukin- Agents Chemother. 1999. V. 43. № 3. Р. 616-22.

12. Kovaks T., Stas I. та ін. Volume regulatory mechanisms of human granulocytes in hipoosmotic media // Acta Biochim. Biophys. Hung. 1989. V. 24 № 1-2. P. 142-147.

13. De Weck A.L. pharmacological and immunochemical mechanisms of drug hypersensitivity // Immunol Allergy Clin North Am. 1991. № 11. Р. 461-474.

14. Labro M.T. pharmacology of spiramycin in comparison with other macrolides // Drug Invest 1993. 6. Suppl 1. Р. 15-28.

15. Lachani M., Usmani S. та ін. In vitro ефект furosemideon hemiluminescence polymorphonuclear neutrophils в preterm infants // Biol.Neonate. 1997. V. 72. № 3. P. 142147.

16. Muniz-Junqueira MI, Mota LM, Aires RB, Junqueira LF Jr. Digitalis inhibites і furosemide не змінює in vitro phagocytic function neutrophils of healthy subjects // Int Immunopharmacol. 2003. V. 3. № 10-11. P. 1439–1445.

17. Munoz J., Geister R. Inhibition of phagocytosis by aureomycin // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1950. V. 75. № 2. Р. 367-370.

18. Richardson M.D., Donaldson F. Interaction of Candida crusei з людськими neutrophils in vitro // J. Med. Microbiol. 1994. V. 41 № 6. P. 380-388.

19. Vetvica V., Thornton BP, Ross CP. Додаткові бета-glucan polysaccharide binding до lectin site of neutrophil або натуральний кільцевий комп'ютерний рецептор Type 3 (CD 11b/CD 18) генерується послідовним датою receptor capable of mediating citotoxicity IC3b - opsonized target cells // J. Clin. Invest. 1996. V. 98. P. 50-61.

Фагоцитоз - процес, у якому спеціально призначені при цьому клітини крові та тканин організму (фагоцити) захоплюють і перетравлюють тверді частки. Відкриття фагоцитозу належить І. І. Мечнікова. Він здійснюється двома різновидами клітин: зернистими лейкоцитами (гранулоцитами), що циркулюють у крові, і тканинними макрофагами. У тварин фагоцитувати можуть ооцити, плацентні клітини, клітини, що вистилають порожнину тіла, пігментний епітелій сітківки ока.

Механізм фагоцитозу однотипний і включає 8 послідовних фаз: 1) хемотаксис (спрямований рух фагоциту до об'єкта);

2) адгезія (прикріплення до об'єкту);

3) активація мембрани (актин-міозинової системи фагоциту);

4) початок власне фагоцитозу, пов'язане з утворенням навколо поглинається частинки псевдоподій;

5) утворення фагосоми (частина, що поглинається, виявляється укладеною у вакуоль завдяки насуву на неї плазматичної мембрани фагоциту подібно до застібки-блискавки;

6) злиття фагосоми з лізосомами;

7) знищення та перетравлення;

8) викид продуктів деградації із клітини.

Фагоцитоз часто передує процес опсонізації (від грец. opsoniazo - постачати їжею, живити) об'єкта. Об'єктом є клітина, яка несе чужорідну інформацію. Ініціатором цього процесу є утворення на поверхні клітини комплексу антиген-антитіло. Антитіла, локалізуючись на поверхні чужорідної клітини, стимулюють активацію та приєднання до них білків системи комплементу. Утворений комплекс діє як активатор інших стадій фагоцитозу.

Більш детально етапи фагоцитозу виглядають так:

1. Хемотаксис. Чужорідні клітини (опсонізовані чи неопсонизированные) посилають у довкілля хемотаксические сигнали, у бік яких починає рухатися фагоцит. Раніше інших клітин у вогнище запалення мігрують нейтрофіли, пізніше – макрофаги.

2. Адгезія фагоцитів до об'єкта. Зумовлена ​​наявністю на поверхні фагоцитів рецепторів для молекул, представлених на поверхні об'єкта (власних або пов'язаних із ним). Акт адгезії включає дві фази: розпізнавання чужорідного (специфічний процес) та прикріплення, або власне адгезію (неспецифічний процес). Якщо відсутнє попереднє специфічне розпізнавання чужорідних клітин, адгезія клітини фагоциту до об'єкта фагоцитозу відбувається вкрай повільно.

3. Активація мембрани. На цій стадії здійснюється підготовка об'єкта до занурення. Відбувається активація протеїнкінази, вихід іонів кальцію з внутрішньоклітинних депо. Велике значення грають переходи золь-гель у системі клітинних колоїдів та актино-міозинові перебудови.

4. Занурення. Відбувається обволікання об'єкта. У процесі фагоцитозу плазматична мембрана макрофага за допомогою утворених нею виступаючих складок захоплює об'єкт фагоцитозу та обволікає його.

5. Утворення фагосоми. Відбувається замикання мембрани, занурення об'єкта із частиною мембрани фагоциту всередину клітини. Невелика вакуоль, що утворюється при цьому, називається фагосомою.

6. Утворення фаголізосоми. Злиття фагосоми з лізосомами, у результаті утворюються оптимальні умови для бактеріолізу та розщеплення вбитої клітини.

7. Кіллінг та розщеплення. У фагосомі захоплена чужорідна клітина гине. Для здійснення кілінгу макрофаг продукує та секретує у фагосому реакційноздатні похідні кисню. Основні речовини, що беруть участь у бактеріолізі: пероксид водню, продукти азотного метаболізму, лізоцим та ін. Процес руйнування бактеріальних клітин завершується завдяки активності протеаз, нуклеаз, ліпаз та інших ферментів.

Перетравлення захопленого та вбитого матеріалу - завершальний етап фагоцитозу. Для цього з фагосомою, що містить об'єкт фагоцитозу, поєднуються лізосоми, які містять більше 25 різних ферментів, до яких входить велика кількість гідролітичних ензимів. У фагосомі відбувається активація цих ферментів, так званий метаболічний вибух, у результаті якого фагоцитований об'єкт перетравлюється.

8. Викид продуктів деградації.

Фагоцитоз може бути:

ѕ завершеним (кілінг та перетравлення пройшло успішно);

ѕ незавершеним (для низки патогенів фагоцитоз є необхідним ступенем їх життєвого циклу, наприклад, у мікобактерій та гонококів).

Вивчення показників фагоцитозу має значення в комплексному аналізі та діагностиці імунодефіцитних станів: часто рецидивуючих гнійно-запальних процесах, що довго не гояться ран, схильності до післяопераційних ускладнень.

Для дослідження фагоцитарної функції використовують:

ѕ підрахунок абсолютного числа фагоцитів (нейтрофілів та моноцитів);

ѕ оцінку інтенсивності поглинання мікробів фагоцитами;

ѕ визначення здатності фагоцитуючих клітин перетравлювати захоплені мікроби.

Найбільш інформативним для оцінки активності фагоцитозу вважають фагоцитарне число, кількість активних фагоцитів та індекс завершеності фагоцитозу.

Найбільш поширеним методом кількісного визначення та характеристики морфологічних дефектів нейтрофілів є лейкограма та цитологічні дослідження з використанням світлової та електронної мікроскопії.

Для визначення хемотаксичної активності нейтрофілів застосовують метод дослідження міграції лейкоцитів із використанням камери Бойдена. Метод заснований на розділенні мікропористим фільтром у розчині двох реагуючих компонентів: нейтрофілів та хемотаксичних агентів (наприклад, C5a), які поміщаються в нижню камеру та створюють концентраційний градієнт. Поміщені у верхню камеру нейтрофіли мігрують уздовж градієнта і збираються на нижній поверхні фільтра. Після стандартної інкубації фільтри виймають, фарбують і підраховують кількість клітин. Метод досить простий і відрізняється дуже високою відтворюваністю. Цей принцип лежить в основі методу клітинної міграції під агарозним гелем, який використовується для визначення хемотаксичного індексу.

Для фагоцитарного числа норма – 5-10 мікробних частинок. Це середня кількість мікробів, поглинених одним нейтрофілом крові. Характеризує поглинальну здатність нейтрофілів. Визначається шляхом підрахунку кількості поглинених бактерій однією клітиною після інкубації клітин пацієнта зі стандартними препаратами St.aureus або E.coli та забарвлення отриманих мазків. Модифікацією цього тесту є метод визначення бактерицидної активності, при якому відмита суспензія клітин інкубується з бактеріальною суспензією, потім суміш наноситься на поверхню кров'яного агару і через певний час підраховується кількість бактеріальних колоній, що виросли. Обидва методи вимагають стандартизації для використання в кожній лабораторії та відомостей про антибіотикотерапію, яка може бути причиною недостовірних результатів або помилок в їх інтерпретації.

Фагоцитарна ємність крові в нормі - 12,5-25х109 на 1 л крові. Це кількість мікробів, які можуть поглинути нейтрофіли 1 л крові.

Фагоцитарний показник у нормі 65-95%. Це відносна кількість нейтрофілів (виражена у відсотках), що беруть участь у фагоцитозі.

Кількість активних фагоцитів у нормі - 1,6-5,0х10 9 в 1 л крові. Це абсолютна кількість нейтрофілів, що фагоцитують, в 1 л крові.

Індекс завершеності фагоцитозу в нормі - більше 1. Він відображає здатність фагоцитів, що перетравлює.

Фагоцитарна активність нейтрофілів зазвичай підвищується на початку розвитку запального процесу. Її зниження веде до хронізації запального процесу та підтримки аутоімунного процесу, тому що при цьому порушується функція руйнування та виведення імунних комплексів з організму.

Спонтанний тест з НСТ (нітросиній тетразолій) – в нормі у дорослих кількість НСТ-позитивних нейтрофілів становить до 10%. Цей тест дозволяє оцінити стан кисневого механізму бактерицидності фагоцитів (гранулоцитів) крові in vitro. Він характеризує стан та ступінь активації внутрішньоклітинної НАДФ-Н-оксидазної антибактеріальної системи. Феномен респіраторного (або метаболічного) вибуху пов'язаний зі значним збільшенням кисню, що поглинається лейкоцитами при фагоцитозі, внаслідок чого відбувається утворення супероксидного радикалу (О3-) та перекису водню. Всі ці сполуки мають мікробоцидні властивості, і їх ідентифікація є важливим етапом в оцінці функціональної активності фагоцитарних клітин.

Показники НСТ-тесту підвищуються в початковий період гострих бактеріальних інфекцій, тоді як при підгострому та хронічному перебігу інфекційного процесу вони знижуються.

Зниження спонтанного тесту з НСТ характерне для хронізації запального процесу, уроджених дефектів фагоцитарної системи, імунодефіцитів, злоякісних новоутворень, тяжких опіків, травм, недостатності харчування, лікування деякими лікарськими препаратами, впливу іонізуючого випромінювання.

Підвищення спонтанного тесту з НСТ відзначають при антигенному подразненні внаслідок гострого бактеріального запалення, лейкоцитозу, посилення антитілозалежної цитотоксичності фагоцитів, аутоалергічних захворювань, алергії.

Активований тест із НСТ використовується для визначення фагоцитарної метаболічної (кисне-залежної) активності нейтрофілів. Тест включає інкубацію нейтрофілів з НСТ in vitro, і з формування нерозчинних пофарбованих зерен формазану можна судити про відновлення НСТ супероксидним радикалом, що утворюється при активації фагоцитів. Відсутність осаду свідчить про нездатність клітинної популяції фагоцитів до метаболізму.

У нормі у дорослої людини кількість НСТ-позитивних нейтрофілів становить 40-80%. Зниження показників активованого НСТ тесту нейтрофілів нижче 40% і моноцитів нижче 87% свідчить про недостатність фагоцитозу.

Фагоцитарна активність лейкоцитів– це визначення вмісту нейтрофілів і моноцитів здатних пов'язувати на своїй поверхні, поглинати та перетравлювати мікробну тест-культуру (мічені бактерії).

Показання до призначення лабораторного дослідження:

• Часті повторні інфекційні захворювання,
• рецидивні гнійні запальні процеси,
• рани, що довго не гояться,
• часті післяопераційні ускладнення,
• підозра на аутоімунні захворювання,
• динамічний нагляд за такими хворими, оцінка активності та ефективності терапії при колагенозах та ревматичних хворобах.

Причини підвищення фагоцитарної активності лейкоцитів:

• гострі бактеріальні інфекції.

Причини зниження фагоцитарної активності лейкоцитів:

• імунодефіцити уроджені
• хронічні інфекції
• аутоімунні захворювання
• алергічні захворювання
• вірусні інфекції
• синдром набутого імунодефіциту людини

Спеціальної підготовки до дослідження не потрібне. Необхідно дотримуватись загальних правил підготовки до досліджень.

ЗАГАЛЬНІ ПРАВИЛА ПІДГОТОВКИ ДО ДОСЛІДЖЕНЬ:

1. Для більшості досліджень кров рекомендується здавати вранці, в період з 8 до 11 години, натщесерце (між останнім прийомом їжі та взяттям крові повинно пройти не менше 8-ми годин, воду можна пити у звичайному режимі), напередодні дослідження легка вечеря з обмеженням прийому жирної їжі. Для тестів на інфекції та екстрених досліджень допустимо здавати кров через 4-6 годин після останнього прийому їжі.

2. УВАГА!Спеціальні правила підготовки для низки тестів: строго натщесерце, після 12-14 годинного голодування, слід здавати кров на гастрин-17, ліпідний профіль (загальний холестерин, холестерин-ЛПВЩ, холестерин-ЛПНЩ, холестерин-ЛПОНП, тригліцериди, тригліцериди, аполіпо-протен А1, аполіпопротеїн В); глюкозотолерантний тест виконується вранці натще після 12-16 годин голодування.

3. Напередодні дослідження (протягом 24 годин) виключити алкоголь, інтенсивні фізичні навантаження, прийом лікарських засобів (за погодженням із лікарем).

4. За 1-2 години до здачі крові утриматися від куріння, не вживати сік, чай, каву, можна пити негазовану воду. Виключити фізичну напругу (біг, швидке піднесення сходами), емоційне збудження. За 15 хвилин до здавання крові рекомендується відпочити, заспокоїтися.

5. Не слід здавати кров для лабораторного дослідження одразу після фізіотерапевтичних процедур, інструментального обстеження, рентгенологічного та ультразвукового досліджень, масажу та інших медичних процедур.

6. При контролі лабораторних показників у динаміці рекомендується проводити повторні дослідження в однакових умовах – в одній лабораторії, здавати кров у однаковий час доби та ін.

7. Кров для досліджень слід здавати до початку прийому лікарських препаратів або не раніше, ніж через 10–14 днів після їх відміни. Для оцінки контролю ефективності лікування будь-якими препаратами слід проводити дослідження через 7–14 днів після останнього прийому препарату.

Якщо Ви приймаєте ліки, обов'язково попередьте про це лікаря.