Головна » симптоми вуха » Клітини-макрофаги: розвиток, поширення, функції і захворювання. Вчені знайшли спосіб регулювати активність макрофагів Респіраторний вибух і внутрішньоклітинний киллинг при неспецифічному імунітеті

Клітини-макрофаги: розвиток, поширення, функції і захворювання. Вчені знайшли спосіб регулювати активність макрофагів Респіраторний вибух і внутрішньоклітинний киллинг при неспецифічному імунітеті

2 Малишев І.Ю. 1, 2

1 ГБОУ ВПО «Московський державний медико-стоматологічний університет» Міністерства охорони здоров'я і соціального розвитку Російської Федерації, Москва

2 УРАМН НДІ загальної патології і патофізіології РАМН, Москва

Значиму роль в ініціації та розвитку запальних реакцій в легенях грають альвеолярнімакрофаги - одні з центральних клітин системи вродженого імунітету. Важливими компонентами вродженого відповіді є здатність макрофагів до фагоцітірованія і їх міграційна активність. Альвеолярнімакрофаги провоспалительного М1 фенотипу, виділені від мишей лінії С57 / BL6, мають більшу фагоцитарної активністю по відношенню до S.aureus в порівнянні з виділеними від мишей лінії BALB / c альвеолярними макрофагами антизапальної М2 фенотипу. При порівняльному аналізі міграційної активності встановлена альтернативна залежність показника активності від типу використовуваного хемоаттрактанта.

макрофаги

фенотип макрофагів

фагоцитоз

міграційна активність

1. Macrophage phenotype as a determinant of biologic scaffold remodeling / S.F. Badylak, J.E. Valentin, A.K. Ravindra et al. // Tissue Eng Part A. - 2008. - Vol. 14. Issue 11. - P. 1835-42.

2. Benoit M., Desnues B., Mege J.L. Macrophage Polarization in Bacterial Infections // The Journal of Immunology. - 2008. - Vol. 181. - P. 3733-3739.

3. Cairo G., Locati M., Mantovani A. Control of iron homeostasis as a key component of macrophage polarization // Haematologica. - 2010. - Vol 95, Issue 11. - P. 1801-1803.

4. Pulmonary Immunobiology and Inflammation in Pulmonary Diseases. NHLBI Workshop Summary / D. Crapo, A.G. Harmsen, M.P. Sherman, R.A. Musson // Am J Respir Crit Care Med. - 2000. - Vol. 162. - P. 1983-1986.

5. Frevert, Wong, Goodman et al. Rapid Fluorescence-based Measurement of Neutrophil Migration in Vitro // Journal of Immunological Methods. - 1998. - Vol. 213. - P. 41-52.

6. Goldmann O., von Köckritz-Blickwede M., Höltje C. et al. Transcriptome Analysis of Murine Macrophages in Response to Infection with Streptococcus pyogenes Reveals an Unusual Activation Program // Infect Immun. - 2007. - Vol. 75, Issue 8. - P. 4148-57.

7. Lasbury, M.E., Durant P.J., Lee C.H .. Numbers of alveolar macrophages are increased during Pneumocystis pneumonia in mice // J. Eukaryot. Microbiol. - 2003. - Vol. 50 (Suppl). - P. 637-638.

8. Lay J.C., Alexis N.E., Zeman K.L., et al. In-vivo Uptake of Inhaled Particles by Airway Phagocytes is Enhanced in Mild Asthmatics Compared to Normal Volunteers // Thorax. - 2009. - Vol. 64. - P. 313-320.

9. Martinez F.O., Sica A., Mantovani A. et al. Macrophage activation and polarization // Front Biosci. - 2008. - Vol. 13. - P. 453-61.

10. Platt N., Haworth R., da Silva R.P., Gordon S. Scavenger receptors and phagocytosis of bacteria and apoptotic cells // Advances in Cellular and Molecular Biology of Membranes and Organelles. - 1999. - Vol. 5. - P. 71-85.

11. Stangel M., Joly E., Scolding N.J., Compston D.A.S. Normal polyclonal immunoglobulins ( 'IVIg') inhibit microglial phagocytosis in vitro // Journal of Neuroimmunology. - 2000. - Vol. 106 (1). - P. 137-144

12. Tumitan A.R., Monnazzi L.G., Ghiraldi F.R. et al. Pattern of macrophage activation in yersinia-resistant and yersinia-susceptible strains of mice // Microbiol Immunol. - 2007. - Vol. 51 (10). - P. 1021-8.

Запальні реакції грають виключно важливу роль у розвитку великої кількості захворювань легенів, таких як бронхіальна астма, гострий респіраторний дисстресс синдром і бронхолегенева дисплазія. Відомо, що одну з центральних ролей в ініціації та розвитку запальних реакцій в легенях грають альвеолярнімакрофаги. При активації ці клітини продукують вільні радикали, NO, цитокіни, кемокіни і інші медіатори запалення і завдяки цьому запускають вроджений і адаптивний імунну відповідь і знешкоджують патогенні мікроби.

В ході імунної відповіді нативні макрофаги можуть набувати різні функціональні фенотип. Так, класичний М1 фенотип характеризується продукцією прозапальних цитокінів та кемокінов, таких як TNF-α, IL-1ß, IL-6, IL-12, запального білка макрофагів 1α (MIP-1α), а також підвищеної генерацією оксиду азоту (NO). М1 макрофаги є ефекторними клітинами, які інтегровані в Th1 відповідь. Цей фенотип вбиває мікроорганізми і пухлинні клітини і продукує велику кількість прозапальних цитокінів. Альтернативний М2 фенотип макрофагів характеризується продукцією антизапальних цитокінів, таких як IL-10 і рецептор-пастки IL-1 (IL-1ra). Функціональне призначення М2 фенотипу полягає насамперед у регулюванні запальної відповіді, участь у ангіогенез, ремоделировании тканин і відновлення імунного гомеостазу, порушеного запаленням.

Очевидно, що ефективність, з якою вроджений імунітет буде видаляти патогенні мікроби і при необхідності стимулювати ангіогенез, ремоделирование і відновлення пошкоджених тканин, істотно залежить від фагоцитарної активності макрофагів, і від того, як швидко ці клітини можуть приходити в осередок запалення, тобто від їх міграційної активності.

Таким чином, здатність до фагоцітірованія і міграційна активність макрофагів становлять важливі компоненти вродженого відповіді, від якого залежить, як швидко імунна система зможе відновити гомеостаз, порушений появою інфекції і пошкодженням тканин. Однак до сих пір важливе питання про те, які відмінності фагоцитарної здатності та міграційної активності М1 і М2 фенотипів макрофагів залишається відкритим.

Мета даної роботи полягала в тому, щоб відповісти на це питання.

Матеріали і методи дослідження

миші

Для вивчення функціональних відповідей (визначення фагоцитарної і міграційної активності) виділення альвеолярнихмакрофагів проводилося у мишей різних ліній. Відомо, що різні генетичні лінії тварин можуть мати різні фенотипи макрофагів. Наприклад, миші лінії С57 / BL6 мають М1 фенотип, тоді як миші Balb / c - М2 фенотип. Миші ліній С57 / BL6 і Balb / c були отримані з віварію ГБОУ ВПО МДМСУ Мінздоровсоцрозвитку Росії, Москва, Росія. Для досліджень використовувалися самці обох ліній, вік 10-12 тижнів, масою 23-28 г. Дослідження проводилися відповідно до правил належної лабораторної практики (GLP). Миші містилися в умовах віварію, що не допускають попадання патогенних мікроорганізмів.

Виділення альвеолярнихмакрофагів

Альвеолярнімакрофаги виділялися з бронхоальвеолярного лаважу (БАЛ) мишей. Попередньо мишам внутрішньоочеревинно вводився розчин хлоралгідрату (з розрахунку 32,5 нг на 100 г ваги тварини), згодом миші умерщвлялись за допомогою перерізання нижньої порожнистої вени і знекровлення. Для отримання бронхо-альвеолярного лаважу (БАЛ) в легені через внутрішньотрахеальне катетер вводилося по 1 мл стерильного фосфатного буфера PBS 37 ° С (у кожної тварини виконувалося по 4 промивання). Отриманий БАЛ Центрифуговані при 1000 об. / Хв 4 хв. Клітинний осад ресуспендували в 3 мл середовища RPMI 1640 з подальшим визначенням кількості макрофагів в камері Горяєва і доведенням концентрації клітин в середовищі RPMI 1640 до 1 ∙ 106 / мл.

Визначення фагоцитарної активності альвеолярних макрофагів

Визначення фагоцитарної активності макрофагів вироблялося на суспензії клітин, отриманих з бронхо-альвеолярного лаважу за методикою, зазначеної вище. Як об'єкт фагоцитозу використовували інактивований нагріванням штам Staphylococcus aureus 9198. Бактеріальну суспензія готували з добової культури убитих прогреванием при температурі 56 ° С протягом 1 години мікроорганізмів з наступною триразовою відмиванням в стерильному фізіологічному розчині. За стандартним зразком каламутності ВЗГ 42-28-85П 10 одиниць (ГИСК ім. Л.А. Тарасевича) визначали концентрацію бактеріальних клітин, доводячи до 1 ∙ '10 9 / мл. У промарковані лунки 24-ямкового планшета вносили макрофаги в середовищі RPMI 1640 з концентрацією 1 ∙ 10 6 / мл і Staphylococcus aureus 9198 (концентрація мікроорганізмів у підготовленого штаму становить 1 ∙ '10 9 / мл) в співвідношенні макрофаги / стафілокок - 1: 400; 1: 600; 1: 800; 1: 1000) до загального обсягу 1 мл / лунка. Планшет з макрофагами і мікроорганізмами інкубували протягом 3 годин при температурі 37 ± 0,5 ° С при 5% СО 2. Через 3 години лунки планшета промивалися розчином Хенкса (+ 4 ° С), висушують при кімнатній температурі протягом 30 хвилин з наступною фіксацією абсолютним етиловим спиртом і фарбою за Романовським-Гімзою. Фагоцитарна функція макрофагів оцінювалася прямим візуальним підрахунком поглинених мікробів. При використанні прямого візуального методу розраховувався фагоцитарний індекс (ФІ) - відсоток фагоцитуючих клітин від загального числа і фагоцитарне число (ФЧ) - середня кількість мікробів, захоплених однією клітиною (оцінювалося тільки для фагоцитуючих клітин).

Визначення міграційної активності макрофагів

Визначення міграційної активності макрофагів вироблялося на суспензії клітин, отриманих з бронхо-альвеолярного лаважу за методикою, зазначеної вище, ресуспендувати в хемотаксической середовищі (RPMI без фенолового червоного 96 мл, 1М HEPES - 1 мл, 7,5% NaHCO3 - 2 мл, 200 mM L-глутамін - 1 мл, BSA - 0,5 г).

В основі методики визначення міграційної активності альвеолярних макрофагів лежить принцип методу Бойд, заснований на проходженні лейкоцитів з однієї половини камери з суспензією клітин в іншу половину камери, яка містить хемоатрактант, і розділених між собою мембраннимфільтром. Аналіз хемотаксиса проводився безпосередньо за методикою Neuro Probe Protocol.

У нижні промарковані мікроячейкі камери вносили по 30 мкл хемоаттрактанта (використовували БАЛ мишей лінії С57 / BL6 і Balb / c), поміщали фільтр з діаметром пор 8 мкм, камеру закривали і в верхні мікроячейкі камери вносили по 100 мкл суспензії клітин (з концентрацією 1 ∙ 106 / мл) в хемотаксической середовищі. Заповнену камеру інкубували протягом 3 годин при температурі 37 ± 0,5 ° С при 5% СО2. Через 3 години з верхніх осередків камери проводилася аспірація клітин, осередки заповнювалися 2 мМ ЕДТА в 1 ∙ PBS на 15 хвилин з наступною аспірацією ЕДТА. Камеру відкривали і клітини з верхньої сторони мембрани видаляли за допомогою Q-наконечника. Потім мембрану центрифугировали при 1500 g 15 хвилин (при +4 ° С). Фарбування мембрани проводили АЗУР-еозином за Романовським протягом 15 хвилин. Підрахунок кількості мігрували клітин проводився в кожному осередку під оптичним мікроскопом.

Для оцінки міграційної активності нами був використаний індекс міграції - відношення кількості мігрували клітин до кількості немігріровавшіх в одній лунці.

Результати дослідження та їх обговорення

На малюнку представлені дані про фагоцитарної активності макрофагів двох фенотипів в залежності від співвідношення кількості бактерій на один макрофаг.

Порівняльна оцінка фагоцитарної активності макрофагів М1 фенотипу, виділених
з мишей лінії С57 і макрофагів М2 фенотипу, виділених з мишей лінії BABL / c

Видно, що при будь-яких співвідношеннях середня кількість бактерій, поглинених одним М1 макрофагом, було достовірно більше, ніж у М2 макрофагів. Це означає, що М1 фенотип більш ефективно фагоцітірует S.аureus, ніж М2 фенотип. При цьому фагоцитарна активність М1 фенотипу більше залежала від концентрації S. Aureus, ніж у М2 фенотипу. На графіку це відображається в більш крутому підйомі кривої М1, в порівнянні з М2.

Далі в таблиці представлені дані про міграційну рухливості макрофагів М1 і М2 фенотипів у відповідь на два різних типи хемоаттрактантов: БАЛ, виділений з мишей лінії BALB / c (БАЛ BALB / c), і БАЛ з С57 (БАЛ С57).

Порівняльна оцінка міграційної активності макрофагів М1 фенотипу, виділених з мишей лінії С57, і макрофагів М2 фенотипу, виділених з мишей лінії BABL / c. Міграційна активність кількісно оцінювалася по міграційному індексу, представленому як співвідношення кількості мігрували клітин до немігріровавшім

Ці дані дозволяють зробити кілька важливих висновків.

По-перше, порівняльна оцінка міграційної рухливості М1 і М2 фенотипів альтернативно відрізняється в залежності від того який тип хемоаттрактанта-БАЛ був використаний. Дійсно, в разі, коли в якості хемоаттрактанта використовується БАЛ BALB / c, активність макрофагів М2 істотно вище, в порівнянні з М1 (1,88 ± 0,13 vs 1,12 ± 0,12, р< 0,01). В том же случае, когда в качестве хемоаттрактанта используется БАЛ С57 , активность макрофагов М1 существенно выше, по сравнению с М2 (1,50+0,11 vs 0,93 ± 0,12, р < 0,01).

По-друге, міграційна активність М2 макрофагів, виділених з мишей BALB / c у відповідь на «рідний» БАЛ BALB / c, достовірно вище, ніж активність М1 макрофагів, виділених з мишей С57 у відповідь на свій «рідний» БАЛ С57 (1, 88 ± 0,13 vs 1,50 ± 0,11, р< 0,05).

По-третє, міграційний рух макрофагів на власний «рідний» БАЛ істотно вище, ніж на «чужорідний» БАЛ. Так, міграційна активність макрофагів М2 фенотипу, виділених з мишей BALB / c у відповідь на свій БАЛBALB / c, була в два рази вище, ніж на чужорідний БАЛС57 (1,88 ± 0,13 vs 0,93 ± 0,12, р< 0,001). Аналогичным образом, миграционная активность макрофагов М1 фенотипа, выделенных из мышей С57 в ответ на свой БАЛС57, была почти в полтора раза выше, чем на чужеродный БАЛBALB/c (1,50 ± 0,11 vs 1,12 ± 0,12, р < 0,05).

Результат того, що макрофаги М1 фенотипу, виділені від мишей С57, мають більшу фагоцитарної активністю по відношенню до S.aureus, в порівнянні з макрофагами М2 фенотипом, виділеними від мишей BALB / c, є цілком передбачуваним. Ймовірно, в значній мірі це пов'язано з тим, що М1 макрофаги імунологічно «орієнтовані» на захоплення внутрішньоклітинних мікробів, таких як бактерії і віруси, і вони, в порівнянні з М2 фенотипом, мають більше представництво мікробних патерн-розпізнавальних рецепторів фагоцитозу.

М2 фенотип бере участь в ремоделюванні і відновленні пошкоджених тканин, тому більше «орієнтований» на захоплення мертвих фрагментів загиблих клітин або сторонніх неживих частини-
чек. Тому не виключено, що при використанні замість S.aureus, наприклад, частинок фарби або латексних кульок, фагоцитоз М2 фенотипу буде більш ефективний у порівнянні з М1. Підтвердження цьому дійсно є в літературі. Так показано, що по відношенню до латексних кульок і частинкам зімозана фагоцитоз М2 фенотипу був більш ефективний, порівняно з М1 фенотипом.

Таким чином, порівняльний висновок про фагоцитарної активності різних фенотипів макрофагів повинен завжди враховувати природу фагоцітіруемий агента: бактерії, частинки фарби, або мертві фрагменти клітин. У нашому випадку, щодо S.aureus фагоцитарна активність М1 фенотипу була істотно вище, в порівнянні з М2 фенотипом макрофагів.

При порівняльному аналізі міграційної активності складається аналогічна ситуація, а саме, наші дані показали, що порівняльна оцінка альтернативно залежить від типу використовуваного хемоаттрактанта. Очевидно, що з'ясування причин такої залежності зажадає докладної розшифровки складу хемоаттрактантних молекул в двох типах БАЛ і відповідь на питання, які відмінності між БАЛBALB / c і БАЛС57 за змістом хемоаттрактантних кемокінов, цитокінів, сурфактантних білків і ін.

Очевидно, що в наших умовах, міграційна активність макрофагів залежала від двох чинників:

1) власна здатність макрофагів того чи іншого фенотипу до руху;

2) концентрація і потужність хемоаттрактантних молекул в тому чи іншому БАЛ.

Тому при порівняльній оцінці міграційної активності різних фенотипів макрофагів, виділених з різних ліній тварин, доцільно використовувати інтегральний підхід, тобто оцінювати міграційну активність макрофагів в своїх природних умовах свого БАЛ. При такому підході виявилося, що міграційна активність М2 макрофагів мишей BALB / c виявилася достовірно вище такої для М1 макрофагів мишей С57.

І, нарешті, також заслуговує на увагу ще один цікавий факт, що міграційна активність і М1, і М2 фенотипів істотно знижувалася у відповідь на чужорідний БАЛ. Це здається дивним, тому що макрофаг є саме та клітина імунної системи, яку «чужорідне» має залучати набагато сильніше, ніж «своє». Для відповіді на це питання також необхідно проаналізувати хімічний і молекулярний склад БАЛ мишей різних ліній.

В цілому наші результати показали, що фагоцитарна і міграційна активність М1 і М2 фенотипів макрофагів суттєво різниться, проте висновок про спрямованість цих відмінностей необхідно робити з урахуванням конкретних умов прояви цих активностей.

рецензенти:

Чеснокова Н.П., д.м.н., професор, професор кафедри патологічної фізіології ГБОУ ВПО «Саратовський державний медичний університет ім. В.І. Розумовського »Міністерства охорони здоров'я і соціального розвитку РФ, м Саратов;

Архипенко Ю.В., д.б.н., професор, зав. лабораторією адаптаційної медицини факультету фундаментальної медицини МДУ ім. М.В. Ломоносова, м.Москва.

Робота надійшла до редакції 10.11.2011.

бібліографічна посилання

Лямина С.В., Веденікін Т.Ю., Круглов С.В., Шімшелашвілі Ш.Л., Буданова О.П., Малишев І.Ю., Малишев І.Ю. ОСОБЛИВОСТІ ФАГОЦИТАРНОЇ І МІГРАЦІЙНОЇ АКТИВНОСТІ альвеолярнихмакрофагів М1 І М2 фенотип // Фундаментальні дослідження. - 2011. - № 11-3. - С. 536-539;
URL: http://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=29267 (дата звернення: 13.12.2019). Пропонуємо вашій увазі журнали, що видаються у видавництві «Академія природознавства»

Макрофаги - це клітини, які відіграють ключову роль в запаленні. Нові дослідження - під керівництвом Трініті-коледжу в Дубліні в Ірландії - виявили раніше невідомий процес, який може відключити синтез запальних факторів в макрофагах.

Вчені припускають, що нове відкриття поліпшить наше розуміння запалення і інфекції.

Вони сподіваються, що це призведе до нових методів лікування запальних патологій, таких як серцеві захворювання, ревматоїдний артрит і запальні захворювання кишечника.

Їх недавнє відкриття відноситься до молекули, відомої як ітаконат, Яку макрофаги виробляють з глюкози. Попередні дослідження вже показали, що ітаконат допомагає регулювати функцію макрофагів, але механізми в той час були невідомі.

Давно відомо, що макрофаги викликають запалення, але тільки що ми виявили, що їх можна "зупинити" за допомогою ітаконата.

Використовуючи людські клітини і мишачі моделі, Luke O'Neill і його колеги виявили, що виробництво ітаконата було схоже на активацію "вимкненого перемикача" на макрофаге, яка приводила до зниження запалення.

Дослідники повідомляють про свої висновки в статті, опублікованій в журналі Nature.

Запалення і макрофаги

Запалення - це серія біохімічних реакцій, що запускаються імунною системою, коли вона виявляє те, що може завдати шкоди нашому організму. Ми можемо бачити і відчувати запалення, коли, наприклад, поранили палець: область рани набухає, червоніє, проріджується і стає болючою.

У міру розвитку процесу запалення групи різних клітин виділяють речовини, які, в свою чергу, викликають ряд реакцій. Наприклад, вони змушують кровоносні судини розширюватися і ставати проникними, так що більшу кількість клітин крові може досягати місця пошкодження. При цьому відбувається подразнення нервових закінчень, Щоб повідомлення про біль транслювалися в мозок.

Однак ця потужна система захисту також може спрацьовувати, коли імунітет помилково атакує здорові клітини і тканини (явище, відоме як аутоагрессия імунної системи). Це призводить до хронічних запальних захворювань, які можуть тривати багато років, а іноді навіть все життя.

Макрофаги являють собою різноманітні клітини, які беруть участь у багатьох важливих процесах в організмі, включаючи запалення.

Ітаконат і інтерферони типу I (ІФН I)

Як і багато клітини, макрофаги в якості енергії використовують глюкозу. Однак, вони також можуть використовувати глюкозу для виробництва ітаконата. Вчені знали, що ітаконат допомагає регулювати багато клітинні процеси в макрофагах, але пов'язана з цим біохімія була неясна.

У новому дослідженні професор Luke O'Neill зі своєю командою вперше показали, що ітаконат необхідний для активації протизапального фактора транскрипції в макрофагах миші і людини.

Nrf2 - це білок в організмі ссавців, який відіграє вирішальну роль у відновленні пошкоджених тканин і перешкоджає виникненню злоякісних новоутворень. Виявляючи проблему, білок Nrf2 може активувати до двохсот генів, за допомогою яких буде проведений "ремонт" клітини.

Учені продемонстрували, як, змінюючи виробництво декількох запальних білків, ітаконат захищав мишей від смертельного запалення, яке може виникнути під час інфекції.

Одним з ефектів виробництва ітаконата було обмеження запальної реакції, що включає інтерферони I типу.

Інтерферони I типу (ІФН I) представляють собою групу білків, які впливають на імунні реакції, що виникають при зараженні вірусами, бактеріями, грибами та іншими патогенами.

Відомо, що білки особливо важливі для захисту від вірусів. Однак вони можуть також викликати небажані реакції при деяких типах інфекцій.

Ітаконат є критичним протизапальну метаболітом, який діє через Nrf2, щоб обмежити запалення і модулювати інтерферони I типу.

Будучи першим, хто описує хімічні реакції, пов'язані з протизапальними ефектами ітаконата, дослідження представляє собою новаторську роботу в галузі вивчення запалення.

Тепер вчені планують з'ясувати, як використовувати отримані результати для створення нових протизапальних препаратів.

Ми сподіваємося, що наша робота зможе допомогти багатьом людям з аутоімунними захворювання.

На додаток до дослідників з Трініті-коледжу в Дубліні, участь в роботі брали вчені з Гарвардської медичної школи в Бостоні, Університету Джонса Хопкінса в Балтіморі, Університету Кембриджу, Оксфордського університету, Університету Данді і фармацевтичної компанії GlaxoSmithKline.

Макрофаги - це що за істоти? Або формування? За що вони відповідають в нашому організмі? На ці, а також на ряд подібних питань і будуть дані відповіді в рамках статті.

Загальна інформація

Мононуклеарні фагоцити (або ж макрофаги) - це група клітин, які довго, які здатні до фагоцитозу. Вони мають досить багато спільних функцій, які ріднять їх з нейтрофілами. Також макрофаги - це активні учасники складних запальних та імунних реакцій, де вони виступають в ролі секреторних клітин. Як же вони функціонують? Макрофаги подібно нейтрофилам залишають шляхом діапедезу судинне русло і починають йти своїм шляхом - циркулювати в крові. Але направляються вони в тканини. Після цього і відбувається трансформація моноцити → макрофаги. І вже в місці прибуття вони будуть виконувати свої специфічні функції, які залежать від анатомічної локалізації. Відноситься це до печінки, легким, кістковому мозку і селезінці. У них вони будуть займатися видаленням шкідливих часток і мікроорганізмів з крові. У що ж вони можуть «перетворитися»? Купферовскіе і мікрогліевскіе клітини, альвеолярні макрофаги, макрофаги селезінки, лімфовузлів, кісткового мозку- ось у що вони трансформуються.

функціонал

На макрофаги організму покладено дві основні функції, які і виконуються різними типами:

Усунення корпускулярних антигенів. Цим займаються так звані «професійні» макрофаги.
Поглинання, процесинг і представлення антигену для Т-клітин. Ці завдання виконують вже АПК. Таке скорочення використовується через довгої назви суб'єктів мікрорівня - антігенпрезентірующіх клітин.

Коли з промоноцітов кісткового мозку утворюються дорослі формації, то особливо багато з них потрапляють (і затримуються там) в лімфоцити. Макрофаги тривалий час виконують свій функціонал завдяки тому, що це довгоживучі клітини, у яких добре розвинені мітохондрії і шорсткий ендоплазматичнийретикулум.

Детальніше про завдання

Але найбільшу увагу все ж слід приділити боротьбі з найпростішими, вірусами і бактеріями, які існують всередині хазяйських клітин. Реалізовується це завдяки наявності бактерицидних механізмів, якими володіють макрофаги. Це призводить до того, що вони є одним з найпотужніших інструментів вродженого імунітету. Але і це не все. Вони разом в Т- і В-лімфоцитами беруть участь у формуванні імунної відповіді. Крім цього, не можна не відзначити роль макрофагів в загоєнні ран, ліквідації клітин, що вже віджили своє, і при утворенні атеросклеротичних бляшок. Вони буквально пожирають шкідливі елементи в нашому організмі. Про це навіть свідчить їхня назва. Так, в перекладі на російську мову «макрофаг» - це «великий пожирач». І слід зазначити, що ці клітини дійсно досить великі.

Які ж бувають види макрофагів?

Оскільки аналізовані нами освіти є тканинними фагоцитами, то в різних частинах тіла можна зустріти різні їх «модифікації». Якщо розглядати абсолютно все, це займе дуже багато часу, тому увага буде приділена найбільш вагомим представникам, таким як:

Альвеолярнімакрофаги. Знаходяться в легенях і займаються очищенням вдихуваного повітря від різних шкідливих і забруднюючих частинок.
Купферовскіе клітини. Вони розташовані в печінці. В основному займаються знищенням старих клітин крові.
Гістоціти. Живуть в сполучних тканинах, тому можна зустріти по всьому організму. Але їх досить часто називають «несправжніми» макрофагами через те, що вони займаються освітою каркаса для більшості структур тіла, а не безпосередньо знищенням різних шкідливих елементів.
Живуть в епітелії і під слизовими оболонками.
Селезінкові макрофаги. Знаходяться в синусоїдних судинах цього органу і займаються виловлювання та знищенням віджилих своє клітин крові. Не дарма селезінку називають кладовищем загиблих еритроцитів.
Перитонеальні макрофаги. Живуть в очеревині.
Макрофаги лімфатичних вузлів. Де вони живуть, очевидно з назви.

висновок

Складний наш організм. Його населяє безліч корисних клітин, які полегшують наше життя. Чи не є ісключеніемі макрофаги. На жаль, іноді їх досвіду не вистачає для того, щоб імунна система працювала необхідним чином. І тоді людина захворює. Але важливою перевагою нашої імунної системи є саме те, що вона вміє пристосовуватися.

макрофаги

З вободние Резидентні

перитонеальні Печінкові

легеневі

Активація - не тільки підвищення активності та посилення метаболізму, цитотоксичності, а й збільшення числа залучених до процесу клітин.

макрофаги

Активовані 5% Інтактні 95%

Активація

специфічна Неспецифічна

(За допомогою Тх1 і АТ) (разл. Фарм. Препарати, ЛПС, токсини)

Модель на перитонеальних МФ

Середовищі 199 (піт.в-ва,

а / б, T = 37 °)

Реєстрація даних

Прямий візуальний підрахунок

Оцінка хемотаксису методом Бойд

НТС-тест

хемілюмінесценція

радіометрія

ферментативні методи

імунологічні методи

цитотоксичність

БЦЖ, Циклофосфамід (Активація)ІЛ-1, ФНП, Ростові фактори, PG E2

атипові

клітини не

чутливі

до даних агентам

Досвід з хітозаном

Макрофаг Т-лімфоцит

Посилення контактного взаємодії тимоцитів з макрофагами ІЛ-2, ІФγ Активація МФ

Короткий екскурс в історію ......................................................................................................... .. 2

Сучасний стан вчення про фагоцитоз ..................................................................... .. 5

Макрофаги перитонеального ексудату як модель

фагоцитозу і порушень фагоцитарної активності .................................................... 13

Отримання моделі ......................................................................................................................... 14

Методи реєстрації результатів ................................................ ............................... ..................... 14

Деякі моделюються процеси

ЗНИЖЕННЯ БАКТЕРІАЛЬНОЇ АКТИВНОСТІ перитонеального

МАКРОФАГІВ МИШЕІ В УМОВАХ поєднувати

ЗАСТОСУВАННЯ стафілококових ентеротоксин ТИПУ А І ендотоксинів ...................................................... 17

СКАСУВАННЯ ПОСИЛЮЮЧОГО фагоцитозу ДІЇ опсоніни

ЗА ДОПОМОГОЮ ФРАГМЕНТІВ АНТИТІЛ ПРОТИ Fc-РЕЦЕПТОРОВ МАКРОФАГІВ ................................. .............................. ..... 18

ПОСИЛЕННЯ ЗА ДОПОМОГОЮ Хітозан РЕАКЦІЇ

КОНТАКТНОГО Взаємодія макрофагів з ТИМОЦИТАХ in vitro .................................................................. .. 19

АКТИВАЦІЯ фагоцитарної КЛІТИН І КЛІТИННОГО

ІМУНІТЕТУ синтетичних поліелектролітів .......................................................................................... 20

АКТИВАЦІЯ МАКРОФАГІВ ПІД ВПЛИВОМ синтетичного антиоксиданту ……………………………………………… 22

Фагоцитарної активності макрофагів

Перитонеального ексудату МИШЕЙ ДІЇ ПРЕПАРАТІВ ПЛАТИНИ ............................................................... 23

ВИВЧЕННЯ ФАГОЦИТАРНОЇ АКТИВНОСТІ перитонеального МАКРОФАГІВ В

ЩОДО YERSINIA PESTIS з дефектними і повноцінний FRA-ГЕНАМИ ......................................................... 25

ВПЛИВ модифікаторів БІОЛОГІЧНОГО ВІДПОВІДІ ПРИРОДНОГО

ПОХОДЖЕННЯ НА ФУНКЦІОНАЛЬНУ АКТИВНІСТЬ МАКРОФАГІВ ......................................................................... 26

Перитонеального макрофагів ЯК МОДЕЛЬ

ДЛЯ ВИВЧЕННЯ атерогенних ПОТЕНЦІАЛУ СИРОВАТКИ КРОВІ .............................................................................. ... 29

ВПЛИВ ГАМК, ГОМК І глутамінової

КИСЛОТИ НА ФУНКЦІОНАЛЬНУ активність фагоцитів ....................................................................................... 32

Висновок .................................................................................. ..................................................................... 33

Деякі інші моделі вивчення фагоцитозу ........................................................................ 34

Література ................................................................................................................................................... ......... 36

Короткий екскурс в історію

Понад 100 років минуло з моменту відкриття фагоцитарної теорії, створеної нашим великим натуралістом, лауреатом Нобелівської премії І. І. Мечникова. Відкриття, осмислення явища фагоцитозу і формулювання в загальних рисах основ фагоцитарної теорії було зроблено ним в грудні 1882 р У 1883 р він виклав основи нової фагоцитарної теорії в доповіді «Про цілющі сили організму» в Одесі на VII з'їзді природознавців і лікарів і опублікував їх у пресі. Були вперше висловлені основні положення фагоцитарної теорії, які І. І. Мечников розвивав в подальшому на протязі всього свого життя. Хоча сам факт поглинання живими клітинами інших частинок був описаний багатьма натуралістами задовго до вченого, однак тільки він дав блискучу тлумачення величезної ролі фагоцитів в захисті організму від хвороботворних мікробів.

Значно пізніше до 70-річного ювілею вченого колега і друг І. І. Мечникова Еміль Ру напише: «Сьогодні, мій друг, Ви спостерігаєте доктрину фагоцитозу зі спокійним задоволенням батька, дитя якого зробило хорошу кар'єру в світі, але скільки занепокоєнь воно Вам доставило! Його поява викликала протести й відвертий спротив і протягом двадцяти років Вам довелося боротися за нього ». Доктрина фагоцитозу «... одна з найбільш плідних в біології: вона зв'язала явище імунітету з внутрішньоклітинним травленням, вона пояснила нам механізм запалення та атрофії; вона оживила патологічну анатомію, яка, не будучи в змозі дати прийнятне пояснення, залишалася чисто описової ... Ваша ерудиція така велика і вірна, що вона служить всьому світу ».

І. І. Мечников стверджував, що «... імунітет в інфекційних хворобах повинен бути приписаний активної целлюлярной діяльності. Серед клітинних елементів фагоцити повинні посісти перше місце. Чутливість і рухливість, здатність поглинати тверді тіла і виробляти речовини, що можуть руйнувати і перетравлювати мікробів - ось головні чинники діяльності фагоцитів. Якщо ці властивості в достатній мірі розвинені і паралізують патогенну дію мікробів, тоді тварина від природи імунно ... коли фагоцити не виявляється наявності всіх або одного з цих властивостей в достатній мірі, то тварина вразливе до інфекції ... ». Разом з тим, якщо бактеріальні продукти викликають у фагоцитів негативний хемотаксис або, якщо при позитивному хемотаксисі фагоцити не поглинають бактерій або поглинають, але не вбивають їх, - також розвивається смертельна інфекція. Рішення фундаментальних проблем порівняльної ембріології і біології, що призвело до найбільших відкриттів вченого, дозволило І. І. Мечникову встановити, що «фагоцитоз надзвичайно поширений у тваринному світі ... як на самому нижчому щаблі тваринної сходи, наприклад, у найпростіших, так і .. .У ссавців тварин і людини ... фагоцити представляють собою мезенхімальні клітини ».

І. І. Мечников був в той же час першим, хто зайнявся порівняльним вивченням явища фагоцитозу. Увага вченого було звернуто як на традиційні лабораторні об'єкти, але і на таких представників світу тварин, як дафнії, морські зірки, крокодили, мавпи. Порівняльне вивчення фагоцитозу було необхідно І. І. Мечникову для доказу загальності явищ поглинання і руйнування чужорідного матеріалу фагоцитуючими мононуклеарами, широкого поширення в природі досліджуваної їм форми імунологічної захисту.

Клітинна теоріяМечнікова відразу наткнуласьна опір. Перш всегоона була запропонована в той час, коли більшість патологів бачили в запальної реакції, а також в пов'язаних з нею Мікрофаги і макрофагах НЕ захисну, а шкідливу реакцію. У той час вважали навіть, що, хоча фагоцитирующие клітини дійсно здатні поглинати хвороботворні мікроорганізми, це призводить не до руйнування збудника, а до перенесення його в інші частини тіла і поширенню хвороби. Також в той період часу інтенсивно розвивалася гуморальна теорія імунітету, основи якої були закладені П. Ерліхом. Були відкриті антитіла і антигени, були виявлені механізми гуморальної стійкості організму проти деяких патогенних мікроорганізмів і їх токсинів (дифтерія, правець та ін.). Як це не дивно, але два таких відкриття не могли деякий час ужитися разом. Пізніше в 1888 р Наттолл знайшов в сироватці нормальних тварин речовини, токсичні для деяких мікроорганізмів, і показав, що такі антибактеріальні властивості значно підвищуються в результаті імунізації тварини. Надалі було виявлено, що в сироватці є два різних речовини, спільна дія яких призводить до лізису бактерій: термостабільний фактор, потім ідентифікований як сироваткові антитіла, і термолабільних фактор, названий комплементом, або Алексин (від грец. Aleksein - захищати). Учень самого Мечникова Борде описав лізис еритроцитів гуморальними антитілами і комплементом, і більшість дослідників стали погоджуватися з Кохом, що перемогу здобули гуморалісти. Мечников і його учні отнюдьне збиралися здаватися. Були поставлені прості досліди, в яких мікроби, поміщені в маленький мешочекіз фільтрувального паперу, защіщающійіх від фагоцитів, зберігали свою вірулентність, хоча буквально купалися в тканинної рідини, багатої антитілами. В Англії сер Елмрот Райт і С. Р. Дуглас спробували примирити відмінності між цими двома школамів своїх капітальних дослідженнях процесу опсонізації (від грец. opsonein -робити їстівним). Ці вчені стверджували, що клітинний і гуморальний фактори є однаково важливими і взаємозалежними в тому відношенні, що гуморальні антитіла, специфічно реагіруясо своєю мішенню - мікроорганізмом, готують його до фагоцитозу макрофагами.

У 1908 р Шведська академія удостоїла Нобелівської премії з медицини спільно Мечникова - засновника клітинного напрямки і Ерліха - уособлював гуморалістскіе ідеї тоговремені. Вони були удостоєні премії в якості «визнання їх робіт по імунітету».

Заслуга Мечникова полягає не тільки в створенні їм геніальної теорії. Ще раніше він почав вивчати заразні хвороби людини і домашніх тварин: разом зі своїм учнем М. Ф. Гамалія він вивчав туберкульоз, чуму рогатої худоби, шукав способи боротьби з шкідниками сільського господарства. До 1886 р відноситься одне з найважливіших подій в історії російської медицини. Влітку цього року в Одесі почала працювати створена Мечниковим і його талановитим учнем М. Ф. Гамалія перша російська бактеріологічна станція. Він створив в Росії найбільшу наукову школу мікробіологів. Видатні вчені М. Ф. Гамалія, Д. К. Заболотний, Л. А. Тарасевич та багато інших були учнями І. І. Мечникова. Ілля Ілліч Мечников помер у 1916 році, до кінця життя займаючись питаннями імунології та клітинного імунітету. А наука про імунітет швидко і стрімко розвивалася. У цей період було надзвичайно багато робіт і вчених, які вивчали фактори внутрішнього захисту організму.

Період з 1910 по 1940гг. був періодом серологіі. В цей час було сформульовано положення про специфічність і про те, що АТ є природними, високоваріабельнимі глобулинами. Велику роль тут зіграли роботи Ландштейнера, який прийшов в висновку, що специфічність антитіл не є абсолютною.

З 1905 з'явилися роботи (Сarrel, Guthrie) по трансплантації органів. У 1930р. К.Ландштейнером відкриває групи крові. Роботами по фагоцитозу, бактеріофагії, вірусам, патогенезу чуми займається Амадей Боррель. Премія присуджена Ф. Макфарлейн Бернет (1899 - 1985) і Пітеру Медавар (1915 - Англія) «за відкриття набутої іммунолотіческой толерантності». Медавар показав, що відторгнення чужорідного шкірного трансплантата підпорядковується всім правилам імунологічної специфічності, і в основі його лежать такі ж механізми, як і при захисті від бактеріальних і вірусних інфекцій. Подальша робота, яку він провів разом з низкою учнів, заклала міцну основу для розвитку трансплантаційної іммунобіологіі, яка стала важливою науковою дисципліною і надалі забезпечила багато досягнень в галузі клінічної трансплантації органів. Бернет опублікував книгу «Освіта антитіл» (1941 р.) Зі своїм колегою, Франком Феннер, Бернет стверджував, що здатність до імунологічних реакцій виникає на порівняно пізніх стадіях ембріонального розвитку і при цьому відбувається запам'ятовування існуючих маркерів «свого» у антигенів, присутніх в даний момент. Організм в подальшому набуває до них толерантність і не здатний відповідати на них імунологічної реакцією. Всі антигени, які не запам'яталися, будуть сприйматися як «не свої» та зможуть надалі викликати імунологічний відповідь. Було висловлено припущення, що будь-який антиген, введений протягом цього критичного періоду розвитку, буде потім сприйматися як свій і викликати толерантність, в результаті чого не зможе надалі активувати імунну систему. Ці ідеї були далі розвинені Бернетом в його клонально-селекційної теорії утворення антитіл. Припущення Бернета і Феннера були піддані експериментальній перевірці в дослідженнях Медавар, який в 1953 р на мишах чистих ліній отримали чітке підтвердження гіпотези Бернета - Феннера, описавши феномен, з яким Медавар дав назву придбаної імунологічної толерантності.

У 1969 р. одночасно кількома авторами (Р.Петров, М.Беренбаум, І.Ройт) була запропонована трехклеточная схема кооперації імуноцитів в імунній відповіді (Т-, В-лімфоцитів і макрофагів), що визначила на багато років вивчення механізмів імунної відповіді, субпопуляційний організації клітин системи імунітету .

Істотну роль в цих дослідженнях зіграли кінематографічні методи. Можливість безперервного динамічного вивчення мікробіологічних об'єктів in vivo і in vitro в умовах, сумісних з їх життєдіяльністю, візуалізація невидимих для людського ока електромагнітних випромінювань, реєстрація як швидких, так і повільних процесів, управління масштабом часу і деякі інші характерні особливості дослідницької кінематографії відкрили великі і під багато в чому унікальні можливості для вивчення взаємодії клітин.

Подання про фагоцитах за минулий час було піддано істотній еволюції. У 1970 р Van Furth і співавт. запропонували нову класифікацію, що виділяє МФ з РЕЗ в окрему систему мононуклеарних фагоцитів. Дослідники віддали данину поваги І. І. Мечникову, який користувався терміном «мононуклеарний фагоцит» ще на початку XX століття. Фагоцитарна теорія не стала, однак, незмінною догмою. Безперервно нагромаджувати наукою факти змінили і ускладнили розуміння тих явищ, в яких фагоцитоз здавався вирішальним або єдиним фактором.

Можна стверджувати, що в наші дні створене І. І. Мечникова вчення про фагоцитах переживає своє друге народження, нові факти значно збагатили його, показавши, як це і передбачав Ілля Ілліч, величезна общебиологическое значення. Теорія І. І. Мечникова стала потужним індуктором прогресу імунології в усьому світі, великий внесок в нього внесли радянські вчені. Однак і сьогодні основні положення теорії залишаються непорушними.

Першорядне значення фагоцитарної системи підтверджується створенням в США суспільства вчених, що займаються вивченням ретикулоендотеліальної системи (РЕС), видається спеціальний «Journal of Reticulo-Endothelial Society».

У наступні роки розвиток фагоцитарної теорії пов'язано з відкриттям цитокінової регуляції імунної відповіді і, звичайно, вивчення впливу цитокінів на клітинний відповідь в тому числі і макрофагів. На зорі цих відкриттів стоячи чи роботи таких вчених, як Н.Ерне,

Г. Келер, Ц. Мілштейн.

В СРСР бурхливий інтерес до фагоцитам і пов'язаним з ними процесами спостерігався в 80-і роки. Тут необхідно зазначити роботи А.Н.Маянского, який вивчав впливу макрофагів не тільки в світлі їх імунної функції. Він показав значення клітин РЕМ на функціонування таких органів як печінка, легені, шлунково-кишковий тракт. Роботи також проводили А.Д. Адо, В.М.Земсков, В.Г.Галактіонов, експерименти з вивчення роботи МФ в осередку хронічного запалення ставив Сєров.

Слід сказати, що в 90-і роки інтерес до неспецифическому ланці імунітету впав. Почасти це можна пояснити тим, що всі зусилля вчених були в основному спрямовані до лімфоцитів, але особливо - до цитокінів. Можна сказати, що зараз триває «цитокіновий бум».

Однак це ні в якому разі не означає, що актуальність проблеми впала. Фагоцитоз становить приклад того процесу, інтерес до якого не може пропасти. Буде відкриття нових факторів стимулюючих його активність, будуть виявлені речовини пригнічують РЕМ. Будуть відкриття, уточнюючі тонкі механізми взаємодії МФ з лімфоцитами, з клітинами інтерстицію, з антигенними структурами. Особливо це може бути актуально зараз в зв'язку з проблемою пухлинного росту і СНІД'ом. Залишається сподіватися, що в ряду відкриттів, розпочатих великим Мечниковим, будуть стояти імена російських вчених.

СУЧАСНИЙ СТАН НАВЧАННЯ Про фагоцитозу

Основні положення про фагоцитах і системі фагоцитозу, блискуче сформульовані І. І. Мечникова і розроблені його учнями і послідовниками, надовго визначили розвиток цього найважливішого напряму біології і медицини. Ідея про протиінфекційного імунітету, яка так захопила сучасників І. І. Мечникова, зіграла вирішальну роль в становленні клітинної імунології, еволюції поглядів на запалення, фізіологію і патологію реактивності і резистентності організму. Парадоксально і разом з тим закономірно, що вчення про фагоцитоз почалося з великих узагальнень і концепцій, які протягом багатьох років доповнювалися фактами приватного характеру, мало вплинули на розвиток проблеми в цілому. Хвиля сучасної імунологічної інформації, достаток красних методів і гіпотез направили інтереси багатьох дослідників у бік вивчення лимфоцитарних механізмів клітинного і гуморального імунітету. І якщо імунологи швидко зрозуміли, що без макрофага їм не обійтися, то доля іншого класу фагоцитуючих клітин - полінуклеарних (сегментоядерних) лейкоцитів - до недавнього часу залишалася неясною. Тільки тепер можна з упевненістю сказати, що і ця проблема, зробивши за останні 5-10 років якісний стрибок, міцно утвердилася і успішно розвивається не тільки імунологами, але і представниками суміжних професій - фізіологами, патологами, биохимиками, клініцистами. Вивчення полінуклеарних фагоцитів (нейтрофілів) - один з небагатьох прикладів в цитофізіології, а тим більше в імунології, коли число досліджень на об'єкті «людського походження» перевершує кількість робіт, виконаних в експерименті на тварин.

Сьогодні вчення про фагоцитоз - це сукупність уявлень про вільних і фіксованих клітинах кістковомозкового походження, які, володіючи потужним цитотоксическим потенціалом, виключної реактивністю і високою мобілізаційною готовністю, виступають в першій лінії ефекторних механізмів імунологічного гомеостазу. Протимікробна функція сприймається як приватний, хоча і важливий, епізод цієї загальної стратегії. Доведено потужні цитотоксичні потенції моно- і полінуклеарних фагоцитів, які, крім бактерицидности, знаходять вираз у знищенні малігнізованих та інших форм патологічно змінених клітин, альтерації тканин при неспецифічному запаленні в иммунопатологических процесах. Якщо нейтрофіли (домінуючий тип полінуклеарів) майже завжди націлені на деструкцію, то функції фагоцитів складніше і глибше. Вони беруть участь не тільки в руйнуванні, але і в творенні, запускаючи фібробластіческіе процеси і репаративні реакції, синтезуючи комплекс біологічно активних субстанцій (фактори комплементу, індуктори мієлопоез, імунорегуляторні білки, фібронектину ін.). Збувається стратегічний прогноз І. І. Мечникова, який завжди дивився на фагоцитарні реакції з загальнофізіологічних позицій, стверджуючи значення фагоцитів не тільки в захисті від «шкідливих діячів», а й у спільній боротьбі за гомеостаз, яка зводиться до підтримки відносного сталості внутрішнього середовища організму. «При імунітеті, атрофії, запаленні і лікуванні, у всіх явищах, що мають найбільше значення в патології, беруть участь фагоцити».

Мононуклеарні фагоцити, які раніше відносили до ретикулоендотеліальної системі, виділені в самостійне сімейство клітин - систему мононуклеарних фагоцитів, яка об'єднує моноцити кісткового мозку і крові, вільні, і фіксовані тканинні макрофаги. Доведено, що, виходячи з крові, моноцит змінюється, адаптуючись до умов того середовища, в яку потрапляє. Це забезпечує спеціалізацію клітини, т. Е. Максимальну відповідність тим умовам, в яких їй належить «працювати». Не виключена й інша альтернатива. Подоба моноцитів може бути чисто зовнішнім (як це трапилося з лімфоцитами), і частина з них предетермінірована до трансформації в различнее варіанти макрофагів. Гетерогенність зрілих нейтрофілів хоча і існує, але виражена значно слабкіше. Вони майже не змінюються морфологічно, потрапляючи в тканини, на відміну від макрофагів живуть там недовго (не більше 2-5 діб) і явно не мають пластичністю, властивою моноцитам. Це високодиференційовані клітини, які практично закінчують свій розвиток в кістковому мозку. Не випадково, відомі в минулому спроби відшукати кореляцію між сегментацією ядра і здатністю лейкоцитів до фагоцитозу не увінчалися успіхом. Проте ідея про функціональну неоднорідності морфологічно зрілих нейтрофілів продовжує отримувати підтвердження. Відомі відмінності між нейтрофілами кісткового мозку і периферичної крові, нейтрофілами крові, тканин і ексудатів. Причини і фізіологічний сенс цих особливостей невідомі. Мабуть, мінливість полінуклеарів на відміну від моноцитів-макрофагів носить тактичний характер.

Вивчення фагоцитозу ведеться згідно класичним постулатам І. І. Мечникова про фазах фагоцитарної реакції - хемотаксису, атракції (зв'язуванні) і поглинання, знищення (перетравленні). До характеристики кожного з цих процесів в даний час прикута увага, їм присвячують монографії, огляди. Результати численних досліджень дозволили заглибитися в суть цих реакцій, конкретизувати молекулярні фактори, що лежать в їх основі, намацати загальні вузли і розкрити приватні механізми клітинної реактивності. Фагоцитоз служить прекрасною моделлю для вивчення міграційної функції, просторової орієнтації клітин та їх органел, злиття і новоутворення мембран, регуляції клітинного гомеостазу та інших процесів. Іноді фагоцитоз нерідко ототожнюють з поглинанням. Це явно невдало, бо порушує історично склалося уявлення про фагоцитоз як про інтегральне процесі, який об'єднує суму клітинних реакцій, починаючи з розпізнавання об'єкта і кінчаючи його руйнуванням або прагненням до руйнування. З функціональної точки зору фагоцити можуть перебувати в двох станах - спочиваючому і активованому. У найбільш загальному вигляді активація - є результат перетворення зовнішнього стимулу в реакцію ефекторних органел. Більше пишуть про активоване макрофаги, хоча в принципі те ж саме можна зробити і для полінуклеарів. Треба вибрати лише точку відліку - наприклад, функціональний статус в судинному руслі нормального організму. Активація розрізняється не тільки ступенем збудження індивідуальних клітин, але і масштабом охоплення клітинної популяції в цілому. У нормі активовано невелика кількість фагоцитів. Поява подразника різко змінює цей показник, відображаючи підключення фагоцитів до реакцій, коригуючі внутрішнє середовище організму. Прагнення проактівіровать фагоцитарную систему, посиливши тим самим її ефекторні можливості, неодноразово звучало в роботах І. І. Мечникова. Сучасні дослідження з ад'ювантом, біологічним і фармакологічним модулятора мононуклеарних і полінуклеарних фагоцитів по суті розвивають цю думку з позицій міжклітинної кооперації, спільної програми та приватної патології. У цьому бачиться перспектива раціонального впливу на запалення, репаративні та регенеративні процеси, Іммунопатологію, резистентність до гострого і хронічного стресу, стійкість до інфекцій, пухлин і ін.

Багато ознак активації стереотипні, повторюючись у всіх фагоцитуючих клітин. До них відносяться зміна активності лізосомальних і мембранних ферментів, посилення енергетичного і окисного метаболізму, синтетичних і секреторних процесів, зміна адгезивних властивостей і рецепторной функції плазматичної мембрани, здатності до випадкової міграції та хемотаксису, поглинанню та цитотоксичності. Якщо врахувати, що кожна з цих реакцій по своїй природі інтегративна, то кількість приватних ознак, за якими можна судити про порушення клітин, буде величезним.

Один і той же подразник здатний індукувати все або більшість ознак активації. Однак це, скоріше, виняток, ніж правило. Сьогодні багато відомо про конкретні механізми, що реалізують ефекторні властивості моно і полінуклеарних фагоцитів. Розшифровано структурна основа рухових реакцій, відкриті органели, що забезпечують векторну орієнтацію в просторі, вивчені закономірності та кінетика освіти фаголізосом, встановлена природа цитотоксичності і бактерицидності, визначені синтетичні і секреторні потенції, виявлені рецепторні і каталітичні процеси в плазматичній мембрані та ін. Стає все більш очевидним, що дискретні прояви клітинної реактивності забезпечуються або принаймні ініціюються відокремленими механізмами і можуть виникати незалежно один від одного. Вдається придушити або посилити хемотаксис, не змінивши здатності до поглинання і цитотоксичності, секреція не пов'язана з поглинанням, підвищення адгезивности не залежить від споживання кисню і т. Д. Відомі генетичні дефекти, коли випадає одна або декілька з перерахованих функцій, причому багато хто з них стереотипні по клінічній симптоматиці. Якщо до цього додати патологію медіаторних систем, що генерують хемоаттрактанти і опсоніни, стане зрозуміло, наскільки складним і одночасно конкретним повинен бути сьогодні діагноз, який констатує порушення фагоцитозу.

Короткий екскурс в історію

Сучасний стан вчення про фагоцитоз

Макрофаги перитонеального ексудату як модель

фагоцитозу і порушень фагоцитарної активності

отримання моделі

Методи реєстрації результатів

Деякі моделюються процеси

ЗНИЖЕННЯ БАКТЕРІАЛЬНОЇ АКТИВНОСТІ перитонеального

МАКРОФАГІВ МИШЕІ В УМОВАХ поєднувати

ЗАСТОСУВАННЯ стафілококових ентеротоксин ТИПУ А І ендотоксинів

СКАСУВАННЯ ПОСИЛЮЮЧОГО фагоцитозу ДІЇ опсоніни

ЗА ДОПОМОГОЮ ФРАГМЕНТІВ АНТИТІЛ ПРОТИ Fc-РЕЦЕПТОРОВ МАКРОФАГІВ

ПОСИЛЕННЯ ЗА ДОПОМОГОЮ Хітозан РЕАКЦІЇ

КОНТАКТНОГО Взаємодія макрофагів з ТИМОЦИТАХ in vitro

АКТИВАЦІЯ фагоцитарної КЛІТИН І КЛІТИННОГО

ІМУНІТЕТУ синтетичних поліелектролітів

Фагоцитарної активності макрофагів

Перитонеального ексудату МИШЕЙ ДІЇ ПРЕПАРАТІВ ПЛАТИНИ

ВИВЧЕННЯ ФАГОЦИТАРНОЇ АКТИВНОСТІ перитонеального МАКРОФАГІВ В

ЩОДО YERSINIA PESTIS з дефектними і повноцінний FRA-ГЕНАМИ

ВПЛИВ модифікаторів БІОЛОГІЧНОГО ВІДПОВІДІ ПРИРОДНОГО

ПОХОДЖЕННЯ НА ФУНКЦІОНАЛЬНУ АКТИВНІСТЬ МАКРОФАГІВ

Перитонеального макрофагів ЯК МОДЕЛЬ

ДЛЯ ВИВЧЕННЯ атерогенних ПОТЕНЦІАЛУ СИРОВАТКИ КРОВІ

ВПЛИВ ГАМК, ГОМК І глутамінової

КИСЛОТИ НА ФУНКЦІОНАЛЬНУ активність фагоцитів

висновок

Деякі інші моделі вивчення фагоцитозу

література

Короткий екскурс в історію

Понад 100 років минуло з моменту відкриття фагоцитарної теорії, створеної нашим великим натуралістом, лауреатом Нобелівської премії І. І. Мечникова. Відкриття, осмислення явища фагоцитозу і формулювання в загальних рисах основ фагоцитарної теорії було зроблено ним в грудні 1882 р У 1883 р він виклав основи нової фагоцитарної теорії в доповіді "Про цілющі сили організму" в Одесі на VII з'їзді природознавців і лікарів і опублікував їх у пресі. Були вперше висловлені основні положення фагоцитарної теорії, які І. І. Мечников розвивав в подальшому на протязі всього свого життя. Хоча сам факт поглинання живими клітинами інших частинок був описаний багатьма натуралістами задовго до вченого, однак тільки він дав блискучу тлумачення величезної ролі фагоцитів в захисті організму від хвороботворних мікробів.

Значно пізніше до 70-річного ювілею вченого колега і друг І. І. Мечникова Еміль Ру напише: "Сьогодні, мій друг, Ви спостерігаєте доктрину фагоцитозу зі спокійним задоволенням батька, дитя якого зробило хорошу кар'єру в світі, але скільки занепокоєнь воно Вам доставило! Його поява викликала протести й відвертий спротив і протягом двадцяти років Вам довелося боротися за нього ". Доктрина фагоцитозу "... одна з найбільш плідних в біології: вона зв'язала явище імунітету з внутрішньоклітинним травленням, вона пояснила нам механізм запалення та атрофії; вона оживила патологічну анатомію, яка, не будучи в змозі дати прийнятне пояснення, залишалася чисто описової ... Ваша ерудиція така велика і вірна, що вона служить всьому світу ".

І. І. Мечников стверджував, що "... імунітет в інфекційних хворобах повинен бути приписаний активної целлюлярной діяльності. Серед клітинних елементів фагоцити повинні посісти перше місце. Чутливість і рухливість, здатність поглинати тверді тіла і виробляти речовини, що можуть руйнувати і перетравлювати мікробів - ось головні чинники діяльності фагоцитів. Якщо ці властивості в достатній мірі розвинені і паралізують патогенну дію мікробів, тоді тварина від природи імунно ... коли фагоцити не виявляється наявності всіх або одного з цих властивостей в достатній мірі, то тварина вразливе до інфекції ... ". Разом з тим, якщо бактеріальні продукти викликають у фагоцитів негативний хемотаксис або, якщо при позитивному хемотаксисі фагоцити не поглинають бактерій або поглинають, але не вбивають їх, - також розвивається смертельна інфекція. Рішення фундаментальних проблем порівняльної ембріології і біології, що призвело до найбільших відкриттів вченого, дозволило І. І. Мечникову встановити, що "фагоцитоз надзвичайно поширений у тваринному світі ... як на самому нижчому щаблі тваринної сходи, наприклад, у найпростіших, так і .. .У ссавців тварин і людини ... фагоцити представляють собою мезенхімальні клітини ".

Клітинна теоріяМечнікова відразу наткнуласьна опір. Перш всегоона була запропонована в той час, коли більшість патологів бачили в запальної реакції, а також в пов'язаних з нею Мікрофаги і макрофагах НЕ захисну, а шкідливу реакцію. У той час вважали навіть, що, хоча фагоцитирующие клітини дійсно здатні поглинати хвороботворні мікроорганізми, це призводить не до руйнування збудника, а до перенесення його в інші частини тіла і поширенню хвороби. Також в той період часу інтенсивно розвивалася гуморальна теорія імунітету, основи якої були закладені П. Ерліхом. Були відкриті антитіла і антигени, були виявлені механізми гуморальної стійкості організму проти деяких патогенних мікроорганізмів і їх токсинів (дифтерія, правець та ін.). Як це не дивно, але два таких відкриття не могли деякий час ужитися разом. Пізніше в 1888 р Наттолл знайшов в сироватці нормальних тварин речовини, токсичні для деяких мікроорганізмів, і показав, що такі антибактеріальні властивості значно підвищуються в результаті імунізації тварини. Надалі було виявлено, що в сироватці є два різних речовини, спільна дія яких призводить до лізису бактерій: термостабільний фактор, потім ідентифікований як сироваткові антитіла, і термолабільних фактор, названий комплементом, або Алексин (від грец. Aleksein - захищати) .Ученік самого Мечникова Борде описав лізис еритроцитів гуморальними антитілами і комплементом, і більшість дослідників стали погоджуватися з Кохом, що перемогу здобули гуморалісти.Мечніков і його учні отнюдьне збиралися здаватися. Були поставлені прості досліди, в яких мікроби, поміщені в маленький мешочекіз фільтрувального паперу, защіщающійіх від фагоцитів, зберігали свою вірулентність, хоча буквально купалися в тканинної рідини, багатої антитілами. В Англії сер Елмрот Райт і С. Р. Дуглас спробували примирити відмінності між цими двома школамів своїх капітальних дослідженнях процесу опсонізації (від грец. opsonein -робити їстівним). Ці вчені стверджували, що клітинний і гуморальний фактори є однаково важливими і взаємозалежними в тому відношенні, що гуморальні антитіла, специфічно реагіруясо своєю мішенню - мікроорганізмом, готують його до фагоцитозу макрофагами.

У 1908 р Шведська академія удостоїла Нобелівської премії з медицини спільно Мечникова - засновника клітинного напрямки і Ерліха - уособлював гуморалістскіе ідеї тоговремені.Оні були удостоєні премії в якості "визнання їх робіт по імунітету".

З 1905 з'явилися роботи (Сarrel, Guthrie) по трансплантації органів. У 1930р. К.Ландштейнером відкриває групи крові. Роботами по фагоцитозу, бактеріофагії, вірусам, патогенезу чуми займається Амадей Боррель. Премія присуджена Ф. Макфарлейн Бернет (1899 - 1985) і Пітеру Медавар (1915 - Англія) "за відкриття набутої іммунолотіческой толерантності". Медавар показав, що відторгнення чужорідного шкірного трансплантата підпорядковується всім правилам імунологічної специфічності, і в основі його лежать такі ж механізми, як і при захисті від бактеріальних і вірусних інфекцій. Подальша робота, яку він провів разом з низкою учнів, заклала міцну основу для розвитку трансплантаційної іммунобіологіі, яка стала важливою науковою дисципліною і надалі забезпечила багато досягнень в галузі клінічної трансплантації органів. Бернет опублікував книгу "Освіта антитіл" (1941 р). Зі своїм колегою, Франком Феннер, Бернет стверджував, що здатність до імунологічних реакцій виникає на порівняно пізніх стадіях ембріонального розвитку і при цьому відбувається запам'ятовування існуючих маркерів "свого" у антигенів, присутніх в даний момент. Організм в подальшому набуває до них толерантність і не здатний відповідати на них імунологічної реакцією. Всі антигени, які не запам'яталися, будуть сприйматися як "не свої" і зможуть надалі викликати імунологічний відповідь. Було висловлено припущення, що будь-який антиген, введений протягом цього критичного періоду розвитку, буде потім сприйматися як свій і викликати толерантність, в результаті чого не зможе надалі активувати імунну систему. Ці ідеї були далі розвинені Бернетом в його клонально-селекційної теорії утворення антитіл. Припущення Бернета і Феннера були піддані експериментальній перевірці в дослідженнях Медавар, який в 1953 р на мишах чистих ліній отримали чітке підтвердження гіпотези Бернета - Феннера, описавши феномен, з яким Медавар дав назву придбаної імунологічної толерантності.

Подання про фагоцитах за минулий час було піддано істотній еволюції. У 1970 р Van Furth і співавт. запропонували нову класифікацію, що виділяє МФ з РЕЗ в окрему систему мононуклеарних фагоцитів. Дослідники віддали данину поваги І. І. Мечникову, який користувався терміном "мононуклеарний фагоцит" ще на початку XX століття. Фагоцитарна теорія не стала, однак, незмінною догмою. Безперервно нагромаджувати наукою факти змінили і ускладнили розуміння тих явищ, в яких фагоцитоз здавався вирішальним або єдиним фактором.

Г. Келер, Ц. Мілштейн.

СУЧАСНИЙ СТАН НАВЧАННЯ Про фагоцитозу

Основні положення про фагоцитах і системі фагоцитозу, блискуче сформульовані І. І. Мечникова і розроблені його учнями і послідовниками, надовго визначили розвиток цього найважливішого напряму біології і медицини. Ідея про протиінфекційного імунітету, яка так захопила сучасників І. І. Мечникова, зіграла вирішальну роль в становленні клітинної імунології, еволюції поглядів на запалення, фізіологію і патологію реактивності і резистентності організму. Парадоксально і разом з тим закономірно, що вчення про фагоцитоз почалося з великих узагальнень і концепцій, які протягом багатьох років доповнювалися фактами приватного характеру, мало вплинули на розвиток проблеми в цілому. Хвиля сучасної імунологічної інформації, достаток красних методів і гіпотез направили інтереси багатьох дослідників у бік вивчення лимфоцитарних механізмів клітинного і гуморального імунітету. І якщо імунологи швидко зрозуміли, що без макрофага їм не обійтися, то доля іншого класу фагоцитуючих клітин - полінуклеарних (сегментоядерних) лейкоцитів - до недавнього часу залишалася неясною. Тільки тепер можна з упевненістю сказати, що і ця проблема, зробивши за останні 5-10 років якісний стрибок, міцно утвердилася і успішно розвивається не тільки імунологами, але і представниками суміжних професій - фізіологами, патологами, биохимиками, клініцистами. Вивчення полінуклеарних фагоцитів (нейтрофілів) - один з небагатьох прикладів в цитофізіології, а тим більше в імунології, коли число досліджень на об'єкті "людського походження" перевершує кількість робіт, виконаних в експерименті на тварин.

Сьогодні вчення про фагоцитоз - це сукупність уявлень про вільних і фіксованих клітинах кістковомозкового походження, які, володіючи потужним цитотоксическим потенціалом, виключної реактивністю і високою мобілізаційною готовністю, виступають в першій лінії ефекторних механізмів імунологічного гомеостазу. Протимікробна функція сприймається як приватний, хоча і важливий, епізод цієї загальної стратегії. Доведено потужні цитотоксичні потенції моно- і полінуклеарних фагоцитів, які, крім бактерицидности, знаходять вираз у знищенні малігнізованих та інших форм патологічно змінених клітин, альтерації тканин при неспецифічному запаленні в иммунопатологических процесах. Якщо нейтрофіли (домінуючий тип полінуклеарів) майже завжди націлені на деструкцію, то функції фагоцитів складніше і глибше. Вони беруть участь не тільки в руйнуванні, але і в творенні, запускаючи фібробластіческіе процеси і репаративні реакції, синтезуючи комплекс біологічно активних субстанцій (фактори комплементу, індуктори мієлопоез, імунорегуляторні білки, фібронектину ін.). Збувається стратегічний прогноз І. І. Мечникова, який завжди дивився на фагоцитарні реакції з загальнофізіологічних позицій, стверджуючи значення фагоцитів не тільки в захисті від "шкідливих діячів", але і в спільній боротьбі за гомеостаз, яка зводиться до підтримки відносного сталості внутрішнього середовища організму. "При імунітеті, атрофії, запаленні і лікуванні, у всіх явищах, що мають найбільше значення в патології, беруть участь фагоцити".

Мононуклеарні фагоцити, які раніше відносили до ретикулоендотеліальної системі, виділені в самостійне сімейство клітин - систему мононуклеарних фагоцитів, яка об'єднує моноцити кісткового мозку і крові, вільні, і фіксовані тканинні макрофаги. Доведено, що, виходячи з крові, моноцит змінюється, адаптуючись до умов того середовища, в яку потрапляє. Це забезпечує спеціалізацію клітини, т. Е. Максимальну відповідність тим умовам, в яких їй належить "працювати". Не виключена й інша альтернатива. Подоба моноцитів може бути чисто зовнішнім (як це трапилося з лімфоцитами), і частина з них предетермінірована до трансформації в различнее варіанти макрофагів. Гетерогенність зрілих нейтрофілів хоча і існує, але виражена значно слабкіше. Вони майже не змінюються морфологічно, потрапляючи в тканини, на відміну від макрофагів живуть там недовго (не більше 2-5 діб) і явно не мають пластичністю, властивою моноцитам. Це високодиференційовані клітини, які практично закінчують свій розвиток в кістковому мозку. Не випадково, відомі в минулому спроби відшукати кореляцію між сегментацією ядра і здатністю лейкоцитів до фагоцитозу не увінчалися успіхом. Проте ідея про функціональну неоднорідності морфологічно зрілих нейтрофілів продовжує отримувати підтвердження. Відомі відмінності між нейтрофілами кісткового мозку і периферичної крові, нейтрофілами крові, тканин і ексудатів. Причини і фізіологічний сенс цих особливостей невідомі. Мабуть, мінливість полінуклеарів на відміну від моноцитів-макрофагів носить тактичний характер.

Значною подією стало твердження молекулярних основ цитотоксичності (в тому числі бактерицидности) і її ставлення до реактивності клітин. Прагнення зрозуміти сутність реакцій, що призводять до загибелі поглинених бактерій, проглядає в більшості робіт І. І. Мечникова. Багато років ця проблема традиційно зводилася до "перетравлювання", в якому беруть участь гідролітичні ферменти (цитаза, по І. І. Мечникову), що визначають, як вважали, антимікробні властивості фагоцитів. Ця позиція була сильно похитнулася, після того як виявилося, що лізосомальні гідролази мають слабку бактерицидністю in vitro або позбавлені її. В основу сучасних поглядів покладені спостереження, що свідчать про посилення окисного метаболізму активованих фагоцитів і роз'єднанні двох головних подій - киллинг-ефекту і деградації убитих, нежиттєздатних об'єктів. Колишня термінологія, в якій закріплена причинний зв'язок між знищенням живої мішені і перетравлює функцією клітини, залишена. Перетравлення, яке обумовлено кислими і нейтральними гідролазами, преформованими в гранулах, є вторинним і націлене на об'єкти, убиті залежними і незалежними від кисню механізмами - біооксідантамі, системою мієлопероксидази, катіонними білками, лактоферрином, лізоцимом. Реалізація цитотоксичности відображає реактивне збудження фагоцитуючих клітин, які секретують ефекторні молекули всередину фагосом (з утворенням фаголізосом) або назовні, атакуючи позаклітинні (непоглощенние) об'єкти. Те, що кількість кисню, що поглинається лейкоцитами, значно збільшується при фагоцитозі, відомо давно. Однак справжнє значення цього феномена, який в сучасній літературі часто називають респіраторним, або метаболічним, вибухом, осмислено лише в останні роки. На відміну від багатьох клітин кисневе дихання не є системою життєзабезпечення фагоцитів - вони добре переносять гіпоксію і виконують ряд функцій в умовах анаеробіозу. За допомогою респіраторного вибуху моноцити-макрофаги і нейтрофіли вирішують чисто ефекторні завдання, "озброюючись" проти мікробів і інших об'єктів, які сприймаються ними як антігомеостатіческіе чинники. У анаеробної середовищі фагоцити зберігають здатність до поглинання, але різко знижують токсичність по відношенню до багатьох патогенних і умовно-патогенних бактерій. Ключовий механізм зводиться до активації мембранних оксидаз, каталізують перенесення електронів з НАДФН на молекулярний кисень. Це стимулює окислення глюкози в гексозомонофосфатном шунт, приводячи до гіперпродукції перекису водню і вільних радикалів кисню - біологічних оксидантів з потужними цитотоксичними потенціями. Клінічне значення подібних реакцій стало очевидним після того, як було виявлено фатальне зниження протиінфекційного імунітету у дітей з вродженою патологією системи респіраторного вибуху нейтрофілів. Втім, було б невірно протиставляти різні антимікробні фактори. Їх ефективність багато в чому залежить від взаємної збалансованості умов, в яких відбувається фагоцитоз, виду мікроба. Нейтрофіли, позбавлені можливості використовувати бактерицидні властивості активованого кисню, проте нормально вбивають епідермальний стафілокок, синьогнійну паличку, зеленящий стрептокок, облігатні анаероби. Відносна стійкість до фагоцитозу визначається сумою ознак - поверхневими властивостями мікробної клітини, наявністю факторів типу лейкотоксін і антифагин, інактивацією біооксідантов тощо. Давно виявлена здатність деяких бактерій гальмувати утворення фаголізосом. Цей механізм, який виключає контакт з цитотоксичними компонентами фагоцитів, забезпечує тривале персистування в макрофагах туберкульозної палички, a в нейтрофілах - бруцелл, а також інших мікроорганізмів. Одну з причин бачать у підвищенні внутрішньоклітинного рівня циклічного аденозинмонофосфату, блокуючого мобілізацію гранул і їх злиття з фагосомах. Цей приклад показує, наскільки глибокими можуть бути взаємини, які складаються в процесі фагоцитозу.

Становлення поглядів на механізми цитотоксичності фагоцитів підірвало мечніковских концепції про цитаза як про медіатори, які опосередковують деструктивні функції клітин. І. І. Мечников не раз підкреслював, що, крім руйнування мікробів, фагоцити здатні пошкоджувати власні тканини. Ці ідеї отримали блискучий розвиток в сучасних роботах по ферментології лізосомальних гранул і способам їх підключення до ФАГОЦИТАРНОЇ реакцій. У гранулах моно- і полінуклеарних фагоцитів ідентифікований великий арсенал гідролітичних ферментів (нейтральних і кислих гідролаз), для кожного з яких можна підшукати мішень у позаклітинному просторі. Під їхнім прицілом знаходяться колагенові і еластинових волокна, пептидоглікановому матрикс хряща, фибронектин, фактори комплементу, системи калікреїн-кінінів, згортання, фибрино-лізу, імуноглобуліни, клітинні мембрани. На противагу старим уявленням сьогодні зроблено акцент на активному, секреторному вивільненні ефекторних молекул, яке значно підвищує ефекторну пластичність клітини, дозволяючи в найкоротший термін мобілізувати і раціонально використовувати свої можливості в фізіологічних ситуаціях і в ході різноманітних патологічних процесів. Секретуючи, фагоцити впливають на інші медіаторні системи і руйнують позаклітинні об'єкти, розмір яких виключає можливість поглинання. Так, мабуть, йде справа при емфіземи легенів, в реакціях на імунні комплекси, при гострому і хронічному запаленні. Крім гидролаз і інших компонентів лізосомальних гранул, активовані фагоцити виділяють пірогени, інтерферони і інтерфероноподобние речовини, простагландини, тромбоксани, біооксіданти, монокіни, фактори, що стимулюють попередники мієлопоез тощо. Лейкотрієни викликають скорочення гладких м'язів і підвищення судинної проникності, діючи в 100- 10000 раз сильніше, ніж гістамін.

Прав був І. І. Мечников, коли говорив про широкому спектрізавдань, що вирішуються фагоцитами, і різноманітті їх функціональних контактів ( "живого ланцюга", по І. І. Мечникову) з іншими клітинами і тканинами. Активовані макрофаги і нейтрофіли служать одним з найяскравіших прикладів екстреної мобілізації ефекторних механізмів з великою сферою застосування в масштабі не тільки сполучної тканини, але і всього організму.

Активатори моноцитів-макрофагів і полінуклеарів утворюються в системах комплементу, згортання, фібринолізу, калікреїн-кінінів, імуноглобулінів, виділяються лімфоцитами, фібробластами, тромбоцитами, ендотелієм. Складні взаємини складаються і всередині самої фагоцитарної системи. Моноцитарний інфільтрат при запаленні формується під впливом хемоаттрактантов, що продукуються нейтрофілами, які першими мігрують в зону альтерації. У свою чергу моноцити і макрофаги виділяють фактори, вибірково активують нейтрофіли. Суттєве значення має функціональна кооперація між однотипними фагоцитами, яка передбачає участь "аутокаталітіческіх" механізмів, які контролюють міграційну, секреторну і інші функції активованих клітин. Ліпоксігеназного метаболіти арахідонової кислоти - різні варіанти гідроксіейкозантетраеновие кислоти хемотаксичними в незначних дозах (особливо для нейтрофілів) і, будучи потенційними "осколками" клітинного метаболізму уніфікують сигнали, які забезпечують спрямовану міграцію фагоцитів в осередки тканинного ушкодження. Будь-яка травма будь-якої тканини може стати ініціатором подібних реакцій. У цьому простежується один з універсальних механізмів гомеостазу - всередині популяції фагоцитів, в масштабі сполучної тканини, за її межами.

Зі сказаного випливає важливий висновок. Важко підшукати така зміна внутрішнього середовища організму, яке б не фіксувалося системою фагоцитозу. Будучи потужними ефекторами, фагоцити перетворюються в вузол зв'язку, свого роду стратегічну мету, через яку трансформуються всі реакції крові і сполучної тканини. Особливо показовими є нейтрофіли. Обмінюючись в циркуляції кожні 5 ч, вони як би фотографують зрушення, які відбуваються протягом цього періоду, будучи своєрідним дзеркалом гомеостазу. Не випадково, що індикаторні тести, засновані на високій реактивності полінуклеарів, давно використовуються в клініці і по інформативності нерідко перевершують інші гематологічні показники.

Багато уваги приділяється молекулярним механізмам активації фагоцитів. Відповідно до загальних принципів сучасної цитофізіології схема фагоцитарної реакції передбачає розпізнавання і рецепцію (зв'язування) зовнішнього сигналу, реактивні зміни в плазматичній мембрані, активацію внутрішньоклітинних сигналів-посередників, функціональну трансформацію ефекторних органел. Відкриття стимуляторів з відомою структурою призвело до укладення, що їх вплив на фагоцити опосередковується через дискретні ділянки плазматичної мембрани - специфічні рецептори, які з молекулярної конфігурації комплементарні стимулюючого агенту. Це визначає найважливіше властивість плазматичної мембрани - диференціювати молекулярний профіль зовнішніх подразників і трансформувати його в певну форму клітинної відповіді. Макрофаги і нейтрофіли рецептіруют Fc-фрагмент IgG- і IgA-імуноглобулінів, похідні комплементу (СзЬ, C3d, Сзе, С5а, С567), різні хемоаттрактанти, пектини, бактеріальні глікопротеїди, фибронектин, адрен і холінергічні агенти, гістамін, кортикостероїди, естрогени і пр. Разом вони визначають фармакологічний профіль,

т. е реактивність клітини до відповідного набору функціональних модуляторів. З'ясовується, що рецепторний апарат - дуже динамічна система. Маючи певний стартовий рівень, вона змінюється в залежності від конкретної обстановки і стану клітин. Інтенсивність специфічної рецепції є однією з найцікавіших форм реактивності, управління якою дозволить впливати на найбільш ранні етапи фагоцитарного процесу. Принципово, що експресія різних рецепторів змінюється несинхронно, диференціюється фармакологічними агентами і призводить до неоднаковим функціональним наслідків. Пасивна по чисто зовнішніми ознаками (наприклад, хемоаттрактанти зв'язуються зруйнованими клітинами) рецепція супроводжується молекулярними зрушеннями в плазматичній мембрані, багато з яких грають ключову роль в активації клітини. Один з постулатів сучасної цитофізіології, який стверджує функціональне або навіть структурну єдність рецепторів і ферментів плазматичної мембрани (ектоферментов), знайшов відображення і в дослідженнях по фагоцитозу. У складі плазматичної мембрани фагоцитів виявлені серінестерази, протеїнази, аденілатциклази, оксидази, АТФ-ази. Вважають, що вони активуються при стимуляції, сприймаючи зміни молекулярної топографії клітинної поверхні. Ферментологія плазматичноїмембрани відображає прагнення зрозуміти механізми, які ініціюють переключення енергії роздратування в енергію клітинного збудження Пошуки універсального ферменту-ініціатора зазнали краху, що, скоріше, говорить про специфіку різних форм клітинної реактивності, ніж заперечує саму ідею ектоферментного опосередкування. Чи не увінчалися успіхом і пошуки універсального медиаторного ланки між реакціями плазматичної мембрани і ефекторними органеллами. На цю роль претендували циклічні нуклеотиди, Са2 +, похідні активованого кисню. Кожен з них контролює більш-менш складний набір клітинних функцій, але в цілому їх ефект неуніверсален. Навпаки, є факти, які переконують, що внутрішньоклітинний опосередкування може бути полідетермінантним, т. Е. Залежить від спільної дії декількох медіаторів. Саме таке поєднання визначає кінцеву форму відповіді і властиво більшості фагоцитарних реакцій. За останніми даними, механізми, що забезпечують вихід на одні і ті ж органели, можуть бути неоднакові для різних стимуляторів. Глибоке розвиток отримали ідеї І. І. Мечникова і його сучасників про опсоніни, які зіграли колись вирішальну роль в об'єднанні клітинних і гуморальних концепцій імунітету. Поняття про опсоніни сформульовано в 1903 р, а посилення фагоцитозу в сироваткової середовищі помічено ще раніше. Однак лише останні десятиліття ознаменувалося радикальними успіхами у вивченні молекулярних основ опсоніческой функції і її реалізації на рівні клітин-ефекторів. До родини опсонінов зазвичай відносять чотири групи добре охарактеризованих сироваткових білків - IgG, СЗ (СзЬ), фібронектину, С-реактивний білок, проте насправді їх, очевидно, більше. Найбільш універсальними властивостями володіють СЗЬ- і IgG-антитіла. Співпраця між собою, вони створюють потужний опсоніческій заслін, який традиційно вважається одним з головних факторів протиінфекційного імунітету. Функції інших опсонінов, мабуть, більш обмежені, їх активність сильніше залежить від властивостей фагоцітіруемий об'єкта і типу фагоцитів. Саме неоднорідність субстратів, з якими доводиться стикатися фагоцитуючі клітини, слід вважати першопричиною еволюційно закріпленою гетерогенності опсоніческіх факторів.

Важливим є питання про ставлення фагоцитозу до придбаного (специфічного) імунітету. Класичний постулат І. І. Мечникова про перетравленні антигенного матеріалу фагоцитами як необхідному етапі утворення антитіл трансформувався в сучасну концепцію про пред'явлення антигенних детермінант Т-лімфоцитам у вигляді комплексу з продуктами імунорегуляторних генів (Ia-білками), премійованих на плазматичній мембрані макрофагів. Укупі з медіаторами типу інтерлейкінів це визначає центральну позицію фагоцитів в механізмах формування набутого імунітету. Для нейтрофілів не вдалося домогтися більшого, ніж факту слабкого посилення проліферації В-лімфоцитів нейтральними протеиназами нейтрофілів людини і негативного впливу надлишку нейтрофілів на аналогічний феномен. Швидше за все, це "пробіркових" реакції, які не мають серйозного додатки до регуляції лимфоцитарних функцій in vivo. Інша справа
на рівні ефекторних ланки імунних процесів. По суті, ні один із проявів набутого імунітету не відтворюється повному обсязі без участі моноцитів-макрофагів і (або) полінуклеарів. Про це говорять реакції, наведені антитілами-опсонінами, гіперчутливість уповільненого типу, пошкодження, викликані імунними комплексами, і ін.

Залежить від МФ відповідь лімфоцитів на неспецифічні мітогени - фитогемагглютинин, конканавалін А, перійодат, як і продукція ними лимфокинов - МІФ, МАФ, лімфотоксин і ін. Припускають, що активація Т-лімфоцитів здійснюється безпосередньо вільним або зв'язаним з МФ мітогеном, а МФ виділяє фактор , що трансформує Т-клітини. МФ, виділяючи різні чинники, регулюють проліферацію і диференціювання незрілих кістковомозкових МФ, програнулоцітов, можливо, еритроїдних клітин. Вдалося виявити генетично обумовлені відмінності регулюючого впливу МФ на проліферативну активність стовбурових кровотворних клітин. Макрофаги також за допомогою різних розчинних факторів посилюють проліферацію фібробластів, епідермальних клітин шкіри, ендотелію судин, беруть участь в дозріванні клітин тимуса.

Сьогодні не може бути повністю прийнята гіпотеза про центральну роль тимуса і Т-клітин в протипухлинному нагляді, оскільки є відомості про однаковій частоті виникнення пухлин у бестімусних і нормальних тварин, однаковому їх відторгнення у иммунодефи-цітной або супрессірованних тварин, обмеженому числі пухлин у людей з важкої иммуносупрессией. На думку дослідників, роль Т-лімфоцитів досить однозначна у відторгненні вірусіндуцірованная пухлин, але вона невелика при спонтанних і індукованих канцерогенами неоплазм. Цілий ряд доказів свідчить про складну систему природної та набутої антипухлинних захисту організму і обмеженій ролі в ній Т-лімфоцитів. Про це говорить ранній розвиток природної резистентності до пухлин протягом декількох днів після народження, придушення її при введенні речовин, що пригнічують МФ, безпосередньо перед трансплантацією пухлини або одночасно з нею, збіг індукованої стимуляції резистентності до пухлин з активированием МФ. Тому все більшого значення в цій системі надають МФ. Виявилося, що активований МФ не роблять антипухлинних дію, але становище змінюється при активації клітин, яка може бути специфічною і неспецифічною. Специфічна активація виникає у клітин, взятих з імунного організму або у інтактних МФ, інкубованих з імунними Т-лімфоцитами, з цими лімфоцитами і АГ або з продуктами реакції. МФ в цьому випадку активуються специфічним армуючим чинником, специфічно впізнають і вбивають пухлину в результаті цітолізіса. Неспецифічна активація обумовлена інфекційним процесом, ендотоксинами, ліпідом А, полинуклеотидами, імунними комплексами іншої специфічності. Активовані таким шляхом МФ набувають цитостатичні властивості. МФ можуть армуватися специфічним до даних лімфоцитам чинником інший специфічності на відміну від фактора, індукованого пухлинними АГ, в такому випадку вони стають неспецифічно цитотоксичними по відношенню до пухлини. Тому, якщо до імунних МФ додати специфічні пухлинні клітини, а потім через деякий час неспецифічні, МФ будуть специфічно лизировать гомологичную мішень і неспецифічно придушувати нерідну.

Таким чином, МФ в організмі швидше за все виявляють одночасно специфічну і неспецифічну клітинну цитотоксичність, виявляючи в першому випадку цитолитические, а в другому - цитостатические потенції.

Активовані МФ пригнічують проліферацію нормальних і пухлинних сінгенних, алло-генних і ксеногенних клітин - швидко проліферуючих сильніше, ніж повільно проліферуючих. Однак швидко проліферуючі пухлинні клітини повністю придушуються, тоді як нормальні клітини - лише частково.

Механізм цитотоксичности МФ складний. Специфічний армирующий фактор з молекулярної масою 25000-50000 дальтон має афінність до АГ пухлини, зв'язується з поверхнею МФ, секретується коммітірованних Т-лімфоцитами. Важливий міжклітинний контакт мішені і МФ, який постійно виникає, причому зона контакту має 100-200А. Припускають, що він може сприяти локальному злиття і ін'єкція в мішень лізосом МФ, лізуючого її. За різними даними, киллинг може здійснюватися серинові протеазами, що виникають під впливом лізосомальних гідролаз СЗа-субкомпоненти комплементу, катіонних білком або індукцією макрофагами в мішенях аберантного поділу, що приводить до їх лізису. Разом з тим вважають, що роль простагландинів, аргінази, перекису водню і інтерферону не настільки істотна в безпосередньому цитолітичним ефект.

Певне значення надають зміни структури мембран ефекторів і мішеней, так як обробка МФ фосфолипазой або лізолецітіна індукує в них протипухлинну цитотоксичність, що пояснили можливим утворенням на мембрані цитолітичної структури в результаті зміни її конформації. Подібні процеси, мабуть, відбуваються при активації МФ ліпополісахаридів (ЛПС), в результаті якої ЛПС через ліпід А зв'язується з мембраною М.Ф, змінюючи її організацію в результаті формування комплексу ліпід А - мембранний ліпід, з цієї ж причини, можливо , тумороцідного здатність МФ різко придушувалася після їх експозиції з ліпопротеїдами низької щільності або холестеринів ліпосомами.

В організмі в силу постійного виділення бактеріальних ендотоксинів, імунологічних реакцій різної специфічності, що супроводжуються звільненням лімфокінів, утворенням імунних комплексів, постійно підтримується популяція неспецифічно активованих МФ, що виконують нагляд за спонтанно з'являються трансформованими клітинами і елімінуються їх.

МФ мають величезне значення системи мононуклеарних фагоцитів в природної стійкості організму до пухлин. Оскільки придушення проліферації макрофагами не залежить від виду і типу клітин, показники зростання, трансформації та реактивності, це свідчить про наявність у МФ структур впізнавання, які не мають імунологічної специфічності. У мішенях з'являються загальні зміни, впізнавані всюдисущими МФ, які тому є широкими регуляторами загального клітинного гомеостазу.

За 120 років, що минули з дня створення І. І. Мечникова вчення про фагоцитах, воно пішло далеко вперед. Роль МФ виявилася незмірно більш широкої і вийшла за рамки імунології.

Ця теорія справила глибоке конструктивний вплив на весь розвиток сучасної імунології. Саме вона послужила початком вивчення клітинних аспектів імунітету. Деякі аспекти теорії, передбачені І. І. Мечникова, до сих пір залишаються недостатньо розробленими. Очевидно, що наукова спадщина, що залишається нам І. І. Мечникова, і в майбутньому буде визначати основні напрямки вчення про фагоцитах.

Макрофаги перитонеального ексудату як модель фагоцитозу і порушень фагоцитарної активності.

В організмі людини фагоцитуючих функцію виконують кілька типів клітин. Перш за все, це ті клітини, які здійснюють захист при будь-яких інфекціях і інвазіях - макрофаги, моноцити і нейтрофіли. У меншій мірі вона представлена у еозинофілів і базофілів. Крім того, загальновідомим є той факт, що в різних тканинах фагоцитуючих функцію беруть на себе (крім всюдисущих макрофагів) специфічні клітинні елементи даної тканини, наприклад: фиброкласт, остеокласти, клітини мікроглії. Також не можна забувати про те, що до тих важливим клітинам, завдяки яким йде специфічна імунна відповідь, відносяться дендритні клітини, широко представлені в місцях, які є бар'єрними в організмі. І хоча їх фагоцитуючих функція до кінця не доведена, дані про те, що це так, є.

існують різні методививчення фагоцитуючої активності у клітин, перерахованих вище. В даному рефераті будуть розглянуті методи вивчення тих фагоцитів, у яких фагоцитуючими функція найбільш виражена і які представляють виняткову важливість в імунній системі людини, а їх патологія носить важкий характер. Йдеться про макрофагах (МФ). Вони добре піддаються вивченню in vivoі in vitro, Культивування; моделювання різних процесів на цих клітинах набуло широкого поширення і дало хороші результати. Це обумовлено їх великими розмірами, найширшої поширеністю в організмі, активністю метаболічних процесів, що протікають в них, різноманітністю функцій, на них покладених.

В якості моделі, добре себе зарекомендувала і найбільш часто використовується в дослідах по вивченню фагоцитів, можна розглянути модель перитонеальних макрофагів in vitro.Широке поширення дана модель отримала з кількох причин. По-перше, вона легко відтворюється. По-друге, вона дозволяє легко реєструвати результати досліджень. По-третє, дану модель можна отримати як у лабораторних тварин (щури, миші, морські свинки), так і у людини. По-четверте, при проведенні дослідів на тваринах можна використовувати різні лінії тварин (в т.ч. нокаут-тварин) і тварин з набутими (штучно викликаються) дефектами імунітету. По-п'яте, при постановці дослідів можна індукувати септичне і асептичне запалення, можна перед взяттям клітин провести різноманітні впливи, а на моделі лише зареєструвати результати (тобто сама реакція проходить in vivo).

Сюди можна додати також і інші причини, але обмежимося цими. Природно, ця модель не є єдиною, запропоновані й інші, про які буде згадано нижче.

Отже, розгляд обраної моделі буде відбуватися таким чином:

Варіанти отримання моделі.
Можливі методи реєстрації результатів дослідження.
Різні варіанти модельованих процесів.

Питання, що стосуються практичного аспекту використання результатів дослідження, будуть розглядатися в кожному випадку, а не будуть виноситься в окремий розділ.

I.Полученіе моделі.

Досліди проводять на білих мишах, щурах, морських свинках (в окремих випадках на кроликах) різних ліній (CC57 / W, CBA, "WISTAR", C57BL / 6), а також на нелінійних тварин. Виділяють індуковані і неіндуцірованние МФ. У разі, якщо необхідні інтактні МФ, то тваринам вводять інтраперитонеально стерильний 10% розчин пептона або кілька мл стерильного парафінового масла, можна також використовувати 2,5% розчин крохмалю в фіз. розчині. Зазвичай, через 48 годин наркотизовану тварина забивають, перитонеальну порожнину промивають і перитонеальну рідину відсмоктують. В отриману рідину додають стабілізатор (гепарин, глютатіон) і антибіотики (але тільки не макролідового ряду!), Частіше використовують пеніцилін, стрептоміцин. Далі рідина можна центрифугувати і наступною витримкою, а можна відразу витримувати в скляних кюветах (2 ч). Основний принцип полягає в тому, що макрофаги мають здатність прикріплюватися до скла або пластику, тоді як інші клітини цією здатністю не володіють. Після експозиції саме середовище зливають (або промивають) і готують нову, яка містить гепарин. Отримана таким чином популяція клітин вважається, що складається на 95% з МФ. Далі клітини поміщають на спеціальні середовища (N199) з поживними речовинами і антибіотиками. Зберігатися такі МФ можуть не більше 48-72 годин при підтримці оптимальної температури (37 С) і іонно-осмотичного балансу.

У разі, якщо необхідні активовані МФ, то їх активацію проводять шляхом

Імунізації тваринного введенням різних сироваток або потужних антигенів,
Індукуванням вогнища септичного запалення очеревини (введення токсину в розчині пептона, введення суспензії убитих або живих мікроорганізмів).

Подальші дії збігаються з уже названими.

Цікавим є також виділення людських МФ. Зазвичай, їх отримують з асцитичної рідини хворих з недостатністю кровообігу III ступеня. Потім їх осаджують центрифугуванням (400g, 10 хв), заморожують при температурі рідкого азоту. Після розморожування їх поміщають в спеціальні чашки з середовищем і культивують.

Часом безпосередньо МФ отримані з перитонеального ексудату служать лише для реєстрації досвіду поставленого над твариною in vivoі їх культивування носить тільки діагностичних характер.

II.Регістрація результатів

Після постановки дослідів виникає резонне питання, а як знайти зміну активності МФ, як визначити ті зміни, що вплинули на роботу фагоцитуючих клітин. У нашій країні найбільш широко використовується кілька методів.

Для дослідження поглинальної фази фагоцитозу використовують різні тест-об'єкти. Ними можуть служити крім мікробів еритроцити і різні індиферентні частки: латексу, туші, карміну, колоїдного вугілля, кадмію. Поглинальну активність фагоцитів оцінюють прямим візуальним підрахунком поглинених мікробів або інших частинок всередині МФ, а також по числу частинок, що залишилися непоглощенние, наприклад частинок латексу, за допомогою електронного лічильника часток, еритроцитів по концентрації гемоглобіну спектрофотометрично, емульгованих частинок масляного червоного зі спектрометрической реєстрацією або мічених флюоресцеінізотіоціанатом микрококков за допомогою флюоріметре. Висока точність і продуктивність характеризують метод вивчення фагоцитозу флюоресцирующих частинок латексу за допомогою автоматичного проточного цітофлюо-ріметра. При використанні прямого візуального методу розраховують фагоцитарний індекс (ФІ) - відсоток фагоцитуючих клітин від загального числа, фагоцитарне число (ФЧ) - середня кількість частинок, захоплених однією клітиною. Окремо враховують результати через 1 і 3 ч: відповідно ФІ1, ФІ3, ФЧ1 і ФЧ3, а також коефіцієнт фагоцитарного числа (КФЧ): відношення ФЧ1 до ФЧ3 - показник, що характеризує швидкість фагоцитозу.

Необхідно пам'ятати, що ефективність усіх цих показників залежить від ряду умов, таких як тривалість інкубації, форми дна судини - круглої і конічної (в конічних пробірках спостерігалися більш високі показники фагоцитозу, що, мабуть, обумовлено стимулюючим впливом короткодистанционная взаємодії), pH середовища, змісту кисню і вуглекислоти.

Оцінка хемотаксису лейкоцитів здійснюється двома поширеними методами. Метод Бойд заснований на принципі проходження лейкоцитів з однієї половини камери з суспензією клітин в іншу половину з хемоатрактантом, розділених між собою мембраннимфільтром. Для вивчення хемотаксису макрофагів застосовують фільтри з розміром пор відповідно 5 8 мкм. Наявні різновиди методу Бойд включають двухфільтровий і радіоізотопний варіанти. Інший метод заснований на хемотаксисі під шаром агарози. Як хемоатрактанта частіше використовують оброблену зімозаном або ліпополісахаридом сироватку, казеїн, фільтрат культури Е. coli або інших мікроорганізмів, синтетичні формілпептіди.

Рух клітин при відсутності хемотаксического стимулу дає характеристику

випадкової рухової активності (спонтанна міграція) фагоцитів.

Вимірювання еластичності клітин також можна здійснити в камерах Бойд.

Адгезивні властивості фагоцитів оцінюють по прилипаемости на поверхні скла

або в колонках з намистом. Між здатністю до распластиваніе макрофагів, оп

чати під фазово-контрастним мікроскопом, і фагоцитозу є

певна кореляція

Для оцінки рівня активності МФ використовується полярографический метод (споживання кисню), НСТ-тест (відновлення нітросинім тетразолия), йодування (перехід радіоактивного міченого йоду в кіслотонерастворімий осад), окислення глюкози (освіта молекул 14З2 при окисленні глюкози-1-14С). Дані тести засновані на тому, що активація МФ супроводжується киснево метаболічним "вибухом". Класичним з даних методів став НТС-тест. Справа в тому, що активовані фагоцити здатні поглинати нітросинім тетразолієм (НСТ) і відновлювати його в формазану. НСТ-тест дозволяє диференціювати активовані і інтактні фагоцити, але його не можна вважати кількісним, так як візуальна оцінка результатів суб'єктивна
Також для визначення бактерицидної здатності МФ використовується хемолюмінесцентним метод, запропонований порівняно недавно. Як відомо, фагоцитоз нейтрофілами і макрофагами супроводжується генерацією активних форм кисню (О2, Н2О2, ОН), індукують явище хемілюмінесценції. Остання пропорційна інтенсивності генерації фагоцитами активних форм кисню і може бути непрямим критерієм їх фагоцитарної здатності, тим більше що утворені продукти мають виражені бактерицидні властивості. Метод аналізу хемилюминесценции використовується в клініці і експерименті.

Серед методів реєстрація хемілюмінесценції (ХЛ) є найбільш чутливим і інформативним методом функціональної оцінки фагоцитуючих клітин, але разом з тим і одним з найбільш складних, не стільки в методичному плані, скільки в розумінні природи біохімічних і фізичних процесів, які призводять до випромінювання світла. Механізми, що лежать в основі ХЛ фагоцитів, складні і недостатньо вивчені. Світіння може виникати в реакції O2 + O1 = 2O2 + hV, важливу роль можуть грати радикали ОН. Аналіз різних інгібіторів світіння призводить до думки, що синглетний кисень, гідроксильний радикал і перекис водню залучені в процес ХЛ.

ХЛ фагоцитуючих клітин значно посилюється в присутності люминола або

люцигенина.

Запропоновано багато методів реєстрації ХЛ фагоцитарних клітин, ці методи можна розділити на 2 основні класи.

/. Реєстрація власної ХЛ.Посилення власної ХЛ фагоцитуючих клітин спостерігається при стимуляції опсонізовані зімозаном, бактеріями, частинками латексу. Власна ХЛ клітин має низьку інтенсивність і лежить в широкому спектральному діапазоні з максимумом в області 400-500 нм. Реєстрація ХЛ вимагає високий чутливості приладу і достатньої кількості виділення клітин (зазвичай не менше 106 клітин). Еритроцити, гемоглобін, сироватка крові інгібують ХЛ.

2. ХЛ в присутності люминола. Світіння має на 2- 3 порядки більшу інтенсивність, ніж власна ХЛ. Посилення ХЛ спостерігається при дії зімозана, бактерій, часток латексу, комплексів антиген - антитіло, іонофори кальцію, хемотаксичних пептидів. ХЛ може спостерігатися в суспензії як виділених, клітин, так і клітин в сироватці крові.

Таким чином, хемілюмінесцентний метод дозволяє проводити швидку кількісну оцінку фагоцитарної і бактерицидної активності клітин. Він може використовуватися при дослідженні малих кількостей біологічного матеріалу крові, або може служити як для оцінки стану клітин, так і для оцінки опсоніческой активності сироватки та впливу лікарських препаратів.

Найбільш точними і швидкими методами визначення фагоцитарної активності лейкоцитів є радіометричні. Так, поглинальну здатність оцінюють за рівнем включення ізотопу в фагоцитирующие клітини. Для цього використовують мічені Сr еритроцити, радіоактивну масляну емульсію або мікроби, мічені 14С-гліцином, 3Н-лейцином, 3Н-уридин, або частки 192Ir. Іноді фагоцитоз оцінюють по зменшенню мітки (32Р) в позаклітинному середовищі.

Радіометоди відрізняються швидкістю постановки і об'єктивністю оцінки результатів. Як правило, в кінці інкубації мікробів з фагоцитами останні руйнують осмотичним лізисом, заморожуванням - відтаванням або дезоксихолатом натрію, потім додають на 30 хв при 37 ° С 3 Н-тимідину і підраховують радіоактивність обложених на фільтрі бактерій. За допомогою подвійної мітки визначають одночасно поглинальну і бактерицидну функцію лейкоцитів. Для цього попередньо мітять мікроби одним з ізотопів (14С-фенілаланін, 14С-ацетат натрію), а потім в кінці інкубації руйнують фагоцити і вносять 3 Н-тимідину. Радіоактивність спочатку мічених мікробів, включених в фагоцити, буде відображати їх поглинальну функцію, а радіоактивність, включена в мікроби, після руйнування фагоцитів буде характеризувати їх бактерицидність. Існують авторадіографіческімі методи оцінки завершеності фагоцитозу по включенню ізотопу в процесі інкубації на стеклах монослоя фагоцитів з мікробами.

Одним з показників функціональної активності макрофагів є рівень активності 5'-нуклеотидази. Активність даного ферменту визначають в суспензії не руйнування МФ за методом Туманян і Кірілічевой. Метод відрізняється простотою і точністю, достовірністю, досить часто використовується.

III.Некоторие моделюються процеси.

ЗНИЖЕННЯ БАКТЕРІАЛЬНОЇ АКТИВНОСТІ перитонеального МАКРОФАГІВ МИШЕІ В УМОВАХ поєднане застосування стафілококової

Ентеротоксини ТИПУ А І ендотоксинів

Механізми патогенної дії стафілококових ентеротоксин (СЕ) вивчені недостатньо. Відомо, що блокада ретикулоендотеліальної системи (РЕС) торотраст підвищує чутливість тварин до блювоти, індукованої СЕ. Це передбачає, що функціональний статус РЕЗ грає важливу роль у відповіді організму на ентеротоксин. Дані літератури свідчать і про можливість впливу СЕ на функціонування фагоцитуючих клітин. По-перше, введення СЕ мавпам через шлунковий зонд призводить до розвитку гострого гастроентериту з ексудацією нейтрофілів, макрофагів і іншими ознаками запалення. По-друге, найважливішим властивістю СЕ є здатність сенсибилизировать тварин до летального дії ендотоксинів грамнегативних бактерій (ліпополісахарид - ЛПС), що ставить їх в один ряд з речовинами, що викликають гіперактивацію РЕМ, і також надають сенсибілізуючої дії. Беручи до уваги постійний контакт організму з умовно-патогенними бактеріями, а відповідно і з ендотоксинами кишкової мікрофлори, дослідження макрофагальні функцій, відповідальних за елімінацію мікроорганізмів в умовах впливу СЕ і при поєднанням застосуванні їх з ЛПС, набуває особливої актуальності. У зв'язку з цим, завданням досвіду було вивчення основних закономірностей зміни фагоцитарної і бактерицидної функцій макрофагів під дією СЕ типу А (СЕА) і ЛПС.

I серію дослідів з вивчення фагоцитарної і бактерицидної активності проводили з макрофагами, отриманими від мишей наступних груп: 1-я - через 2 години після ін'єкції ентеротоксину, 2-а і 3-я - через 24 годин після введення СЕА і ЛПС окремо, 4 -я - через 24 годин після введення ендотоксину на тлі СЕА. СЕА викликав дворазове зниження загального числа клітин вже через 2 години після ін'єкції; через 24 год загальна кількість клітин, як і раніше залишалося зниженим. Якщо ЛПС у інтактних мишей сприяв збільшенню виходу клітин в черевну порожнину, то на тлі СЕА їх кількість не тільки не зростала під дією ЛПС, а навіть вірогідно зменшувався в порівнянні з контролем.

Вивчення фагоцитарної і бактерицидної активності макрофагів через 2 години після введення мишам СЕА виявило їх помітне зниження в порівнянні з показниками для контрольних тварин. Через 24 годин після ін'єкції СЕА і ЛПС окремо спостерігалося посилення фагоцитозу. Виявлені закономірності зміни фагоцитарної функції макрофагів цілком узгоджуються з даними літератури, присвяченими вивченню кліренсу вугілля у кроликів після введення стафілококових знтеротоксінов. Н. Sugiyama також спостерігав біфазовие зміни фагоцитарної функції РЕЗ; придушення ступеня кліренсу вугілля через 2год після ін'єкції, що змінюються його збільшенням через добу.

Бактерицидна активність макрофагів, отриманих через 24 годин після обробки тварин окремо СЕА і ЛПС, також зростала. У разі ж спільного введення зазначених токсинів функція поглинання змінювалася незначно, зате ступінь завершеності фагоцитозу різко знижувалася. Необхідно відзначити, що дослідження морфологічного складу клітин перитонеального ексудату мишей через 24 годин після ін'єкції СЕА і ЛПС не виявило суттєвої різниці в процентному співвідношенні макрофагів в дослідних групах тварин. Тому можна стверджувати, що виявлені зміни фагоцитарної і бактерицидної функцій обумовлені впливом досліджуваних токсинів.

Для уточнення характеру впливу СЕА і ЛПС на функціональну активність макрофагів наступну серію дослідів провели в системі in vitro. З цією метою резидентні перитоніт-альні макрофаги, отримані від інтактних тварин, інкубували з токсинами протягом 24 год. В даному випадку функція поглинання змінювалася в меншій мірі. Бактерицидна активність, також як і в дослідах in vivo, підвищувалася під дією СЕА і ЛПС окремо. При одночасному додаванні токсинів до макрофагів бактерицидна функція збільшувалася, а в умовах, що наближаються до таких in vivo, т. Е. При додаванні ЛПС через 4 години після СЕА, здатність макрофагів вбивати Staph. aureus також різко знижувалася.

Таким чином, в умовах поєднаного застосування СЕА і ЛПС відбувається різке зниження функції завершеного фагоцитозу макрофагів. Той факт, що в умовах in vitro простежуються ті ж закономірності, що й в системі in vivo, передбачає, що СЕ надає безпосередній вплив на макрофагальні функції. З огляду на, що фагоцитирующие клітини є першу лінію захисту від надзвичайно поширених умовно-патогенних мікробів, зниження бактерицидних властивостей в умовах синергічної дії СЕ з ендотоксинами грамнегативних бактерій в організмі може привести до розвитку важких септичних ускладнень.

СКАСУВАННЯ ПОСИЛЮЮЧОГО фагоцитозу ДІЇ опсоніни ЗА ДОПОМОГОЮ ФРАГМЕНТІВ АНТИТІЛ ПРОТИ Fc-РЕЦЕПТОРОВ МАКРОФАГІВ

Один з найбільш важливих і давно встановлених імунологічних феноменів - посилення захоплення фагоцитуючими клітинами корпускулярних антигенів після їх сенсибілізації IgG-антитілами - залишався тривалий час маловивченим. Після з'ясування принципів структурної організації молекули IgG і виявлення на поверхні фагоцитів і в тому числі макрофагів рецепторів для Fc-ділянки IgG було постулировано, що опсонізірующая антитіла забезпечують посилення захоплення корпускулярного антигену завдяки взаємодії Fc-ділянки молекули антитіла з Fc-рецептором (FcR) макрофаги. Єдиним експериментальним доказом на користь цього був факт відсутності у Fab-фрагментів опсонізірующих антитіл здатності підсилювати захоплення корпускулярного антигену докази залучення FcR в процес захоплення опсонізовані корпускулярного антигену. Подібний експериментальний підхід не можна розглядати як адекватний для прямого докази залучення FcR в процес захоплення опсонізовані корпускулярного антигену. Виходячи зі сказаного, було вирішено отримати прямі докази ролі FcR в реалізації механізму посилення захоплення макрофагами корпускулярного антигену, сенсибилизированного IgG-антитілами. Це було досягнуто при оцінці впливу на зазначений процес Fab-фрагментів антитіл проти FcR макрофагів, які, як було встановлено, перешкоджають взаємодії з макрофагами агрегованого IgG. Пре-інкубація перитонеальних макрофагів з Fab-фрагментами анти-FcR-антитіл повністю скасовувала ефект посилення захоплення макрофагами опсонізовані антигену.

В результаті експерименту було встановлено, що Fab-фрагмент IgG з анти-FcR-сироватки ефективно блокує FcR мишачих макрофагів, перешкоджаючи зв'язуванню цими клітинами гетерологічного агрегованого IgG. Ці дані добре узгоджуються з фактом блокування FcR перитонеальних макрофагів бівалентності FаЬ-фрагментами з антіFcR. Ці дані в поєднанні з результатами контрольних експериментів, що свідчать про відсутність здатності блокувати FcR Fab-фрагментами IgG з антисироватки проти імунного преципітату, вказують на можливість використання моновалентних Fab-фраг-ментів aнти-FcR-aнтітeл для вивчення функції FcR макрофагів в реалізації дії опсонінов. Слід підкреслити, що використання моновалентних фрагментів анти-FcR-антитіл має принципове значення при вивченні функціональної ролі FcR, оскільки на відміну від нерозщеплених антитіл або бівалентних FаЬ-фрагментів моновалентні Fab-фрагменти нездатні, зв'язавшись з FcR, викликати при 37 ° С їх латеральне переміщення по мембрані цитоплазми і подальший кеппінг.

Отримані дані свідчать, що преінкубація макрофагів з Fab-фрагментами aнти-FcR-антитіл повністю скасовує ефект посилення фагоцитозу S.typhimurium (взяту як об'єкт перевірки ефективності фагоцитозу), обумовлений IgG-антитілами кролика проти цього мікроорганізму. Власне Fab-фрагменти aнти-FcR-антитіл не надають будь-якого впливу на фагоцитоз несенсибілізованих антитілами бактерій. Якщо до макрофагів попередньо додавали Fab-фрагменти антитіл кролика проти імунного преципітату, утвореного яєчним альбуміном і IgG-антитілами кролика проти цього антигену, це не чинило жодного впливу на процес фагоцитозу сенсибілізованих антитілами бактеріальних клітин.

Таким чином, Fab-фрагменти анти-FcR-aнтітел вибірково пригнічують фагоцитоз тільки сенсибілізованих антитілами бактерій. З урахуванням результатів контрольних експериментів це служить безсумнівним доказом на користь того, що посилення захоплення корпускулярного антигену після його опсонізації IgG-антитілами обумовлено взаємодією Fc-навчаючи-стка опсонізірующих антитіл з FcR макрофагів.

Звертає на себе увагу той факт, що макрофаги, попередньо оброблені Fab-фрагментами aнти-FcR-антитіл, менш ефективно поглинають сенсибілізовані антитілами бактеріальні клітини, ніж несенсибілізовані. Цей результат можна пояснити, виходячи з уявлення, що після сенсибілізації бактерій у частині з них відбувається стерическое екранування ділянки клітинної поверхні, за допомогою якого мікроорганізми прикріплюються до макрофагів. Фагоцитоз таких бактеріальних клітин здійснюється, по-видимому, після взаємодії двох молекул антитіл або більше через їх Fс-ділянки з декількома FcR на мембрані цитоплазми макрофагів. Якщо вказане припущення справедливо, захоплення цієї частини сенсибілізованих бактеріальних клітин буде неможливий після блокування FcR за допомогою Fab-фрагментів aнти-FcR-антитіл.

Отримані в даній роботі дані відкривають нові підходи для регуляції процесу імунного фагоцитозу, що може мати суттєве значення для детального аналізу ролі цього процесу при різних патологічних станах.

ПОСИЛЕННЯ ЗА ДОПОМОГОЮ Хітозан РЕАКЦІЇ КОНТАКТНОГО Взаємодія макрофагів з ТИМОЦИТАХ in vitro

Стара і багатогранна проблема иммуностимуляции придбала новий вираз у зв'язку з пошуком шляхів до створення штучних вакцин. Основні зусилля в даному напрямку пов'язані з отриманням кон'югатів вакцинують антигенних детермінант з природними або штучно синтезованими полімерними носіями. Роль носія в такому молекулярному комплексі повинна складатися в посиленні специфічної відповіді на обрану антигенну детермінанту.

При пошуку ефективного носія, який міг би бути використаний при кон'югації з антигеном, необхідно мати відомості про його ад'ювантном ефекті і відсутності побічних патогенетичних властивостей. У зв'язку з цим було звернуто увагу на хітозан - гомополісахарід, що виділяється з хітину зовнішнього скелета безхребетних. Молекулярна маса досліджуваного речовини ~ 120000 дальтон.

Мета дослідження - з'ясувати вплив хітозану на процес контактної взаємодії макрофагів з тімоцітамі в дослідах in vitro. Звернення до даних клітинним типам не випадково. Відомо, що взаємодія макрофагів з тімоцітамі є додатковим фактором трансформації недиференційованих тімусзавісімих клітин в зрілі Т-лімфоцити. У зв'язку з цим цікаво визначити, чи має будь-який вплив обраний гомополімери на один з найбільш ранніх етапів становлення імунної системи - формування функціонально активної популяції зрілих Т-клітин.

Було проведено 3 серії дослідів. У 1-й серії вивчали характер взаємодії сінгенних тимоцитов з прилипають клітинами перитонеального ексудату, які інкубували безпосередньо перед постановкою реакції з однієї з обраних доз хітозану протягом різного часу. Встановлено, що найбільш ефективно реакція гроздеобразованія проходить при 30-хвилинної інкубації макрофагів з хітозаном. Кількість тимоцитов, що групуються навколо макрофагів, в 2,5 рази більше в порівнянні з таким у контролі. У цій же серії дослідів вирішувалося питання про інтенсивність взаємодії аналізованих типів клітин в залежності від дози, використаного для інкубації хітозану, при оптимальному часу інкубації 30 хв. З'ясовано, що найбільше посилення реакції гроздеобразованія спостерігається при додаванні в культуру 50 мкг полісахариду.

У 2-й серії дослідів аналіз реакції гроздеобразованія проведено в умовах попередньої 30- і 60-хвилинної інкубації тимоцитів з різними дозами хітозану. Інкубація протягом як 30, так і 60 хв призводила до посилення контактної взаємодії тимоцитів з макрофагами. Як і в попередній серії дослідів, оптимальна доза, підсилюють ефект гроздеобразованія, дорівнювала 50 мкг.

У заключній 3-й серії дослідів проведено вивчення інтенсивності гроздеобразованія при внесенні хитозана безпосередньо в реагує систему макрофаг-лімфоцит. Як і в 2 попередніх серіях дослідів, констатовано посилення контактної взаємодії тимоцитів з макрофагами.

Для пояснення виявлених фактів необхідно мати на увазі, що хітозан є полікатіоном. У той же час інтегральний заряд як тимоцитов, так і макрофагів негативний. Можливо, ефект посилення контактної взаємодії пов'язаний з електростатичними міжклітинними тяжіння під впливом хітозану, що включають 2 етапи: 1-й етап - ад-гезія позитивно зарядженого хітозану на макрофаге або тімоціте, 2-й - безпосередню взаємодію негативно зарядженої клітини з клітиною-партнером, проінкубованої з полікатіоном і несучої в результаті цього більший позитивний заряд. Подібне уявлення підкріплюється тим, що ефект посилення реакції гроздеобразованія не пов'язаний зі схемою інкубації і буде однаковий незалежно від того, який тип клітин піддавався інкубації з хітозаном.

Другий момент, який вимагає пояснення, - це незначний час інкубації клітин з хітозаном, при якому виявляється ефект посилення контактної взаємодії. Можливо, що відсутність ефекту при більш тривалій інкубації пов'язано з фагоцитозу високомолекулярного полісахариду, внаслідок чого відбувається відновлення вихідного заряду взаємодіючих клітин. Однак представлене пояснення повинно бути підтверджено додатковими експериментальним фактами.

АКТИВАЦІЯ фагоцитарної КЛІТИН І КЛІТИННОГО ІМУНІТЕТУ синтетичних поліелектролітів

Ряд перспективних неприродних поліелектролітів, що використовуються для створення синтетичних вакцин, володіє багатьма імуномоделюючих потенціями: вони підсилюють міграцію стовбурових клітин, Т- і В-лімфоцитів, є стимуляторами Т- і В-клітин, заміщають хелперну функцію Т-лімфоцитів і макрофагів. Ці властивості забезпечують сильну стимулюючу дію на реакції гуморального і клітинного імунітету.

Разом з тим недостатньо ясним залишається питання про їх дії на систему фагоцитарних клітин, формування клітинного, зокрема трансплантаційного, імунітету. Метою цієї роботи було вивчення цих питань.

Методика досліджень була наступною: мишам гібридам (CBAXC57BL / 6) внутрибрюшинно вводили різні дози поліелектролітів одноразово, виділяли МФ через 48 год і аналізували їх.

Введення Поліаніонна NA-5 викликає в макрофагах мишей активацію гліколізу. Наприклад, в 3 експериментах посилення гліколізу в порівнянні з контрольними клітинами було в 1,45, 2,35, 4,3 рази. Це дуже сильна активація гліколізу в клітинах, що свідчить про перехід їх на більш високий фізіологічний рівень метаболізму. Значно зростала в клітинах і інтенсивність гексозомонофосфатного шунта: в 2 з 3 дослідів введення Поліаніонна супроводжувалося появою макрофагів із середньою активністю окислення глюкози, що відповідає 8,67 + 1,47 і 7,24 + 1,95 МФЕ на 10б клітин (в контролі 5, 17 + 0,95 і 4,1 + 1,29 МФЕ на 106 клітин). Ще більш сильною виявилася інтенсифікація циклу сечовини, відмінності якого в порівнянні з контрольними клітинами були вже порядковими. Наприклад, в дослідах 1-3 вони становили відповідно 8,43, 11,54 і 2,06 рази.

Істотне посилення гліколізу обумовлювалося також введенням тваринам карбоцепні поліаміну Н-З: в 2 з 3 дослідів активація була значною, для ЛДГ вона становила в досвідчених макрофагах відповідно 89,27 + 7,41 і 39,54 ± 4,56 МФЕ на 106 клітин, в контрольних - 26,36 + 8,36 і 20,59 + 3,86 МФЕ на 106 клітин. Настільки ж вираженим було посилення активності окислення глюкози, яке перевищувало його в досвідчених макрофагах в порівнянні з контрольними в 3 експериментах відповідно в 2,11, 1,28 і 1,41 рази.

Вкрай значною була інтенсифікація циклу сечовини, так як активація ключового ферменту АРГ зростала в різних дослідах в 3,65-54,6 рази ..

У той же час активність полікатіона D11-100е була значно менш виражена, він не впливав істотно на стан гліколізу і гексозомонофосфатного шунта макрофагів. Однак все ж активність циклу сечовини в клітинах достовірно збільшувалася, хоча і менш істотно, ніж під впливом Н-3 і NA-5.

У макрофагах мишей, стимульованих поліаніоном NA-5, майже двократно підвищувалася активність лізосомальних гідролаз, складаючи в досвіді 27,42 + 4,09 нМ Р / ч на 10б клітин і в контролі 15,04 + 3,66 нМ P / ч на 10б клітин. Активність КФ після введення мишам Н-3 була ще більшою - 35,51 + 4,82 нМ P / ч на 10б клітин. Подібне посилення свідчить про істотному зростанні в макрофагах перетравлює здібності.

У макрофагів мишей поліаніон NA-5 викликав не тільки інтенсифікацію деяких шляхів метаболізму, а й підвищення експресії рецепторів до IgG, яке було різко вираженим, але статистично достовірним.

Дозозалежним виявився відповідь клітини, що виявляються за генерації кисневих радикалів у мишей, яким вводили різні дози поліаміну Н-3. Так, якщо доза 0,5 мг / миша придушувала хемілюмінесценцію макрофагів при фагоцитозі, не змінюючи її при адгезії клітин на скло, то дози 1, 5 і 10 мг / миша вже обумовлювали істотне зростання Хеміле-мінесценціі при фагоцитозі частинок. При адгезії ці дози також виявилися активують, за винятком дози 5 мг / миша. Оптимальне посилення генерації активних кисневих радикалів викликало введення тваринам 1 мг / миша препарату Н-3 - в цьому випадку підвищувалася хемілюмінесценція максимально і при фагоцитозі, і при адгезії. Подальше збільшення дози не супроводжувалось підвищенням дії на клітини. Подібне спостереження повністю підтверджується даними літератури про вплив цього препарату на різні імунологічні параметри.

Таким чином, синтетичні поліелектроліти-поліаніон NA-5 і карбоцепні поліамін Н-3 викликають активацію макрофагів, посилюючи гліколіз, гексозомонофосфатний шунт, цикл сечовини, активність лізосомальних гідролаз. Препарати підвищують також експресію на плазматичній мембрані макрофагів Fcv-peцепторов. Є, однак, особливості, що складаються в тому, що якщо Н-3 викликає посилення генерації макрофагами активних кисневих радикалів, поліаніон NA-5 виявляється в цьому відношенні неактивним. Полікатіон D11-100е чинить менший вплив на макрофаги, проте істотно підвищує на них екс- прес Рс7-рецепторів, інтенсифікує цикл сечовини.

Формування трансплантаційного імунітету вивчали у тварин, які отримували одноразово внутрішньочеревно по 1 мг / миша препаратів в день трансплантації шкіри.

Результати свідчили, що всі 3 препарату викликали посилення трансплантаційного імунітету, що виражається в достовірному прискоренні відторгнення трансплантата у мишей, яким їх вводили. Причому, як і на інших моделях, зокрема при аналізі стану макрофагів в умовах впливу препаратів, активність полііонні D11-100е поступалася активності NA-5 і Н-3. Можна зробити висновок, що полііонні NA-5 і карбоцепні поліамін Н3 мають здатність посилювати клітинний Т-опосередкований імунітет, менш активним був D11-100е.

АКТИВАЦІЯ МАКРОФАГІВ ПІД ВПЛИВОМ синтетичного антиоксиданту

Зараз загальноприйнятою вважається закономірність: активація макрофагів (МФ) пов'язана з метаболічним (окислювальним) вибухом, з активацією глюкозомонофосфатного шунта (ГМФШ), з продукцією і секрецією високоактивних нестабільних продуктів відновлення кисню - супероксіданіон О2 ~, перекису водню (Н2О2), радикалів ОН ~ і синглетного кисню (О2).

Утворений при цьому надлишок токсичних супероксидних радикалів, а також ліпоперекі-сі, що накопичуються в фагосомах МФ в процесі фагоцитозу, можуть обумовлювати окисне пошкодження клітинних мембран і пов'язане з цим придушення функцій МФ. У МФ описана власна система антиоксидантного захисту, що включає супероксиддисмутазу, що видаляє надлишок супероксидних радикалів, а також глу-татіонпероксідазу і НАДФ-залежну глутатіонредуктази, нейтралізуючі ліпоперекісей.

Однак при недостатності ендогенних антиоксидантів можуть виникати різні порушення функцій МФ. Було показано, що алкілзаміщених похідні 3-оксіпірідіна (8 ВП), які надають помірне антиокислювальна дію, є ефективними інгібіторами вільнорадикальних реакцій і можуть бути використані для захисту від деструктивного впливу вільних радикалів.

Метою роботи було вивчення впливу синтетичних антиоксидантів на функції МФ. З ряду синтетичних похідних ОП були обрані 2-третбутіл-З-оксіпірідін (ТБОП), у якого була описана здатність стабілізувати мембрани еритроцитів. Дослідження проводилися в порівнянні зі стандартним активатором МФ - бактеріальним ліпополісахариди (ЛПС з Е. coli О55).

Дані, отримані при вивченні безпосереднього впливу ТБОП в зіставленні з ЛПС на перитонеальні МФ такі: для активації ГФДГ досить півгодинної інкубації клітин з ТБОП. Судячи з показників приросту активності ферменту, ефект ТБОП аналогічний дії стандартного активатора - бактеріального ЛПС. Частка розпластаних МФ зростає в порівнянні з контролем вже через 2 год інкубації з випробуваними препаратами. На ранніх термінах (2 ч) ефект ТБОП більш виражений у порівнянні з ефектом стандартного активатора - ЛПС. На більш пізніх термінах культивування (24 год), який активує ефект ЛПС продовжує наростати, в той же час частка розпластаних МФ під впливом ТБОП має тенденцію до зниження в порівнянні з ранніми термінами, Але залишається достовірно підвищеною в порівнянні з поступово зростаючим контрольним рівнем.

Після внутрішньочеревно введення ТБОП вже через 1 год він викликає виразне підвищення кількості клітин в черевній порожнині за рахунок МФ з переважним накопиченням великих МФ, причому і цей ефект аналогічний дії ЛПС.

МФ, витягнуті з черевної порожнини мишей через 1 год після внутрішньочеревно введення ТБОП, відрізнялися посиленим распластиваніе в порівнянні з МФ контрольних тварин. Фагоцитарна активність цих же МФ була підвищеною, судячи з інтенсивності захоплення ними клітин Candida albicans. У цих умовах експерименту ТБОП в порівнянні зі стандартним активатором - бактеріальним ЛПС - більшою мірою активує распластиваніе, а фагоцитарну активність підвищує в меншій мірі. У більш пізні терміни після введення досліджуваного препарату (1.5- 24 год) подальшого наростання кількості МФ в черевної порожнини і їх функціональної активності не спостерігали. На відміну від цього після введення ЛПС кількість МФ в черевної порожнини і їх функціональна активність досягали максимального рівня лише через 24 год.

У зв'язку з виявленими тимчасовими відмінностями стимулюючих ефектів при вивченні впливу препаратів на інтенсивність очищення черевної порожнини мишей від введених бактерій S. typhimurium (кліренс) ЛПС вводили за 24 год, а ТБОП - за 1 год до зараження. Для оцінки кліренсу обчислювали середні різниці логарифмів концентрації бактерій через 1 год після зараження у мишей контрольних і дослідних груп. Було виявлено значне відставання інтенсивності кліренсу у мишей, які отримали за 4 доби до зараження по 1 мл середовища з тіогліколятом, в порівнянні з контролем.

На малюнку видно, що ні ТБОП, ні стандартний активатор МФ бактеріальний ЛПС не впливають на інтенсивність очищення черевної порожнини від введених бактерій. Однак на тлі дефекту бактерицидності МФ, індукованого попереднім введенням середовища з тіогліколятом, обидва препарати в рівній мірі достовірно підвищують початково знижену інтенсивність очищення черевної порожнини мишей. Під впливом ТБОП, як і під впливом бактеріального ЛПС, спостерігали нормалізацію рівня очищення черевної порожнини, т. Е. Корекцію модельованого в експерименті дефекту бактерицидності МФ.

Таким чином, у вивченого синтетичного антиоксиданту ТБОП виявлена здатність активувати мишачі перитонеальні МФ при безпосередньому впливі in vitro. Після внутрішньочеревно введення того ж препарату спостерігали підвищення кількості МФ в черевної порожнини і їх функціональної активності. У мишей з попередньо індукованим дефектом функції кліренсу черевної порожнини препарат сприяв відновленню нормального рівня антибактеріального захисту. По всіх вивчених тестів активуючого дії на МФ синтетичний антиоксидант не поступалася стандартному активатора МФ - бактеріального ЛПС. При введенні мишам ТБОП спостерігали більш ранні прояви активації МФ в порівнянні з ефектами ЛПС.

Фагоцитарної активності макрофагів перитонеального ексудату МИШЕЙ ПРИ ДІЇ ПРЕПАРАТІВ ПЛАТИНИ

Макрофаги здатні викликати лізис різних типів пухлинних клітин, не пошкоджуючи нормальні клітини того ж гистогенеза. Нормальні "неармовані", активований макрофаги здійснюють взаємодію з пухлинними клітинами на стадії їх виникнення та в період початкової стадії їх розвитку. Речовини-цитостатики, застосовувані в хіміотерапії новоутворень, впливають на імунну систему макроорганізму, зокрема, вражаючи і систему мононуклеаров. Вплив різних класів цитостатиків на функціонування макрофагального ланки імунітету досить глибоко вивчена. Однак даних про характер впливу нового класу протипухлинних сполук - координаційних сполук платини на макрофаги в доступній літературі не зустрічається. Було проведено дослідження - визначення дії препаратів платини на фагоцитарну активність макрофагів перитонеального ексудату. В якості препаратів були взяті Оксоплатіна (цісдіхлородіамінтрансдігідроксоплатіна IV виробництва фірми "Lachema") і ціклоплатам (амінціклопептіламін-5-малатоплатіна (II) вітчизняного виробництва).

В ході проведених досліджень було встановлено, що привнесення препаратів платини безпосередньо в пробірки для рахунку при реєстрації хемілюмінесценції в дослідах in vitro відбувається незначне збільшення вивільнення гідроксильного радикала (ОН ~), супероксіданіон (О2), синглетного кисню ( "02), перекису водню ( H202), що побічно дозволяє судити про стимуляцію фагоцитарної активності перитонеальних макрофагів препаратами платини in vitro. Так, для ціклоплатама максимальне збільшення утворення активних метаболітів кисню спостерігалося в дозі, рівній 0.5 МПД (LD = 23 мг / кг), і індекс хемілюмінесценції становив 3, 2 в порівнянні з 2,28 в контролі, тоді як додавання оксоплатіни в дозі, рівній 1/4 МПД, до суспензії перитонеальних макрофагів викликало збільшення індексу хемілюменісценціі з 1,69 в контрольних пробах до 2,62 в досвіді.

Неоднозначні і досить суперечливі результати були отримані при подальшому дослідженні впливу оксоплатіни і ціклоплатама на фагоцитарну функцію перитонеальних макрофагів in vivo (при введенні препаратів внутрішньочеревно мишам). Введення оксоплатіни і ціклоплатама неімунних мишам викликало придушення фагоцитозу (на 1-й день після введення ціклоплатама у всіх дозах, на 1-й і 2-й дні після введення оксоплатіни у всіх дозах, з встановленням стимулюючого впливу в наступні дні для обох препаратів).

Однак введення оксоплатіни і ціклоплатама в тих же дозах в аналогічні терміни спільно з антигенної стимуляцією дало протилежний ефект. На 1-й день після введення обидва препарати викликали дозозалежне збільшення індексу хемілюмінесценції на 2 і більше порядку (індекс хемілюмінесценції Іхл для оксоплатіни в дозі 1,0 МПД склав 106,9, для ціклоплатама в дозі 1,0 МПД - 407,0, тоді як в контролі - 1,3-2,5). У наступні дні після введення препаратів імунним мишам стимулюючий вплив на фагоцитарну активність перитонеальних макрофагів простежувалося чітко для всіх доз, але носило менш виражений характер.

Передбачається, що при поясненні подібного явища не можна залишити без уваги факт гетерогенності перитонеальних макрофагів і неминучою реакції на внутрішньоочеревинне введення аллоантігени, що виражається в перерозподілі субпопуляцій перитонеальних макрофагів на користь так званих запальних на відміну від резидентних. Не виключено поява незрілих резидентних макрофагів, також характеризуються більшою пероксидазною активністю.

Однак можливо, що за такої постановки реакції реєструвався факт захоплення і поглинання перитонеальними макрофагами часток, якими могли бути (і явно були) не тільки гранули зімозана, але і гетерологічние еритроцити барана. На користь цього свідчать дані роботи, виконаної X. М. Ісинь в лабораторії І. Я. Вчителі, про те, що саме в 1-у добу після імунізації відбуваються максимальний захоплення, поглинання і руйнування макрофагами гетерологічних еритроцитів з подальшою (до 48-ї годині) стабілізацією процесу. Тому робиться висновок, що 1-е добу введення не можуть розглядатися як основоположні при затвердженні стимулюючого впливу оксоплатіни і ціклоплатама на фагоцитарну активність перитонеальних макрофагів, тоді як результати наступних днів є достовірним підтвердженням подібного явища

ВИВЧЕННЯ ФАГОЦИТАРНОЇ АКТИВНОСТІ перитонеального МАКРОФАГІВ ЩОДО YERSINIA PESTIS з дефектними і повноцінний FRA-ГЕНАМИ

Відомо, що можливість розвитку чумної інфекції багато в чому визначається результатом взаємодії клітин збудника Y. pestis з фагоцитами, який залежить від ступеня бактерицидної активності макрофагів (МФ) і наявності антіфагоцітарной факторів у мікробів. До антіфагоцітарной субстанцій Y. pestis відносять термоіндуціруемий капсульний антиген "фракція I", антигени вірулентності V, W, I і ін .. Не виключено існування неідентифікованих компонентів з тією ж функцією. Дія фракції I пов'язують з ингибицией бактерицидної активності МФ, її участь в процесі захоплення бактерій МФ заперечується. Специфічна імунізація тварин призводить до зміни МФ, яке сприяє прискоренню поглинання вірулентних і вакцинних штамів Y. pestis і подальшого їх лізису. В останні роки встановлено, що детермінанти фракції I і VW-антигенів локалізовані на плазміди, які, цілком ймовірно, несуть і іншу генетичну інформацію, поки неідентифікованих, але, можливо, пов'язану з антіфагоцітарной активністю Y. pestis. Наявні в літературі дані про фагоцитоз при чумі отримані в дослідах, в яких не ідентифікувалися, чи пов'язано порушення синтезу досліджуваних антигенів з дефектом окремих конкретних генів або втратою відповідної плазміди цілком. Остання обставина може викликати одночасно дефектність за іншими, ще не дослідженим антигенів. Це ще вимагає уточнення.

Мета роботи - визначення вкладу фракції I в процес взаємодії збудника чуми з індукованими МФ імунізованих та інтактних експериментальних тварин.

У дослідах використовували природний вірулентний штам Y. pestis 4 (Fra +) і ізогенна штам 4 (Fra-), у якого синтез фракції I був "вимкнений" встройкой елемента Tn10 в відповідний ген плазміди. Відчували по 3 клону кожного штаму. Бактерії перед досвідом вирощували протягом 48 год при 28 і 37 ° С на агарі LB ( "Difco") рН 7,2. Фагоцитоз вивчали in vitro в культурі індукованих перитонеальних МФ морських свинок і білих мишей, інтактних і імунізованих підшкірно одноразово в дозі 106 мікробних клітин (МК) чумний вакциною. У дослідах з фагоцитами навантаження становило 50 мікробних клітин (мк) на МФ. Проби інкубували при 37 ° С протягом 6 год. Інтенсивність фагоцитозу оцінювали за допомогою показника активності фагоцитів (АФ) і індексу завершеності фагоцитозу (ІЗФ).

Всі вивчені бактерії, вирощені при 28 ° С (28 ° -культури), коли синтез фракції I знаходиться на дуже низькому рівні, поглиналися однаково незалежно від здатності їх fra-генів нормально функціонувати і від того, виділені випробовувані МФ від імунізованих або інтактних тварин . У дослідах з бактеріями, вирощеними при 37 ° С (37 ° -культури), ефективність захоплення (АФ) у всіх пробах була значно нижче, ніж при 28 ° С .. Оскільки зниження спостерігали у штамів як здатних, так і нездатних продукувати фракцію I , зроблено припущення, що в 37 ° -культуру має місце індукція синтезу або прояв функцій не фракції I, а якихось додаткових компонентів клітинної стінки бактерій, що заважають встановленню контакту бактерій і МФ. Необхідна подальша робота по ідентифікації цих компонентів.

МФ інтактних білих мишей однаково захоплювали бактерії Fra + - і Fra-, МФ імунізованих мишей дещо активніше поглинали Fra + -бактеріі. МФ морських свинок незалежно від того, отримані вони від інтактних або імунізованих тварин, більш активно захоплювали Fra + -бактеріі. Схоже, що в організмі морських свинок щодо випробуваних МФ фракція I проявляє себе як неспецифічний стимулятор фагоцитозу, тоді як в МФ білих мишей повинна відбутися специфічна перебудова, що супроводжує імунізацію, перш ніж фракція I виявиться здатною слабо стимулювати захоплення бактерій збудника. Більш високі значення АФ у вакцинованих морських свинок у відношенні як Fra + -, так і Fra - культур збудника чуми, вирощених при 37 ° С, дозволяють думати також про появу у бактерій при цій температурі культивування додаткових чинників, які мають виборчої активністю саме в відношенні МФ морських свинок. Ще більш виражений стимулюючий ефект цих додаткових факторів проявляється при контакті МФ імунізованих морських свинок з 37 ° -культуру, що містять фракцію I, що дозволяє припустити також і специфічний елемент дії цього антигену, спрямований на посилення захоплення бактерій зазначеними фагоцитами.

Іншими словами, дані експериментів свідчать, що крім фракції I, збудник чуми, вирощений при 37 ° С, містить компоненти, що знижують фагоцитарну активність МФ інтактних і імунізованих тварин, і компоненти, специфічно сприяють захопленню бактерій МФ морських свинок. Дія останніх частково або повністю в присутності фракції I нейтралізує ефект неідентифікованих негативних факторів. Фракція I сприяє захопленню бактерій чуми МФ і більш значима для морських свинок.

У загальному вигляді висновки з даного експерименту можна зробити наступні: 1. Імунізація чумний вакциною морських свинок індукує специфічну щодо фракції I перебудову в макрофагах, що обумовлює посилення захоплення і перетравлення Fra + -Y. pestis виросли при 37 ° С. Подібного не відбувається у білих мишей.

2. Дефект Y. pestis по fra-генам і відсутність фракції I обумовлюють більш виражене зниження ефективності захоплення бактерій, вирощених при 37 ° С макрофагами морських сви-

нок, але не білих мишей і велику ступінь перетравлення макрофагами морських свинок при будь-яких умовах досвіду, а макрофагами білих мишей - тільки щодо 37 ° -культуру.

3. Як в захопленні, так і завершення фагоцитозу роль фракції більш істотна в макрофагах морських свинок.

ВПЛИВ модифікаторів БІОЛОГІЧНОГО ВІДПОВІДІ ПРИРОДНОГО ПОХОДЖЕННЯ НА ФУНКЦІОНАЛЬНУ АКТИВНІСТЬ МАКРОФАГІВ (ОНКОЛОГІЧНИЙ АСПЕКТ)

Незважаючи на значні успіхи хіміотерапії деяких видів злоякісних новоутворень, результати застосування протипухлинних хіміопрепаратів при найбільш поширених локалізаціях раку залишаються малоудовлетворітельно. Стає все більш очевидним, що одним з основних перешкод для успішної хіміотерапії злоякісних пухлин є гетерогенність популяції неопластичних клітин, яка виражається, зокрема, в наявності в ній клонів клітин, резистентних до хіміотерапевтіче-ським агентам. Більш того, така резистентність може ставитися до цілих класів препаратів, що може обмежувати ефективність і комплексної поліхіміотерапії. Ще більш ускладнює становище генетична нестабільність пухлинних клітин, які, маючи високий рівень спонтанних мутацій, надзвичайно легко піддаються мутагенного впливу хіміопрепаратів та продуктів їх метаболізму. Це в значній мірі підсилює гетерогенність пухлинної популяції, сприяє генерації ще більшої кількості резистентних до хіміотерапії клонів, підсилює їх здатність до метастізірованію, рецидиву на тлі триваючої хіміотерапії.

В кінцевому рахунку навіть вельми радикальна (на 99,5%) редукція пухлинної маси в процесі хіміотерапії майже неминуче призводить до відновлення процесу за рахунок резистентних клонів - передували або виникли в процесі хіміотерапії. Більш того, такі клони виявляються в далеко зайшла стадії пухлинної прогресії і, отже, більш злоякісними.

У цих умовах цілком закономірними видаються пошуки шляхів елімінації пухлинних клітин з так званої множинною лікарською стійкістю за допомогою інших механізмів, зокрема литического потенціалу імунокомпетентних клітин. Особливий інтерес в цьому відношенні представляють макрофаги. На відміну від інших типів імуноцитів їх активність в меншій мірі пригнічується в процесі інтенсивної ціторедуктівной терапії, вони здатні до ефективних протипухлинною реакцій в співвідношенні ефектор / мішень, що наближається до 1: 1 і, інфільтруючи пухлинну строму, мають достатню можливість для контакту з пухлинної клітиною. Показана можливість активації цитолітичного дії макрофагів за допомогою різних модифікаторів біологічної відповіді (МБО) після впливу протипухлинних хіміопрепаратів, в той час як активність інших ефекторних систем може бути істотно пригнічена. Тому в даний час йде активна розробка методів ад'ювантної імунотерапії з включенням активаторів макрофагів. При цьому попередня оцінка ефекту останніх проводиться in vitro і в основному за здатністю індукувати цитолітичну і цитостатичну активність. За збереження такої здатності в процесі застосування хіміотерапевтичних протипухлинних препаратів оцінюється і "сумісність" МБО з ними. Однак індукція цитотоксичності є тільки однією стороною активації макрофагів, під впливом МБО відбуваються інші значні зміни функціональної активності цих клітин, зокрема посилюється продукція і секреція цілого ряду ростових факторів. В рамках такого підходу було вивчено вплив БЦЖ і циклофосфаміду на перитонеальні макрофаги мишей. Названі препарати обрані як модельні на увазі їх достатньою вивченості як індукторів протипухлинної активності макрофагів in vitro і in vivo, а також досить широкого застосування в клінічній практиці.

Відомо, що цитотоксическая активність макрофагів in vitro досягає свого максимуму до 48-72 год культивування, а потім швидко знижується. Була проведена оцінка рістстимулюючих активності резидентних і БЦЖ-активованих макрофагів в процесі культивування in vitro.

Встановлено, що здатність підтримувати зростання пухлинних клітин прогресивно знижується у резидентних макрофагів і наростає у БЦЖ-активованих. Якщо в перші 3 дні приріст числа клітин на БЦЖ-активованих макрофагах достовірно нижче, ніж на резидентних (що може бути пояснено цитотоксичною активністю), то потім спостерігається протилежна ситуація.

Таким чином, якщо индуцированная БЦЖ-активація протипухлинної активності макрофагів носить тимчасовий характер, то активація продукції ростових факторів більш стійка в часі. Більш того, при тестуванні цитотоксичної і рістстимулюючих активності макрофагів, що виділяються з перитонеальній порожнині мишей в різні терміни після введення БЦЖ, було виявлено, що цитотоксическая активність (цитолитическая і цитостатична) максимальна на 10-й день. На 15-й і 20-й дні проявляється тільки цитолитическая, а цитостатична активність зникає. Рістстимулюючих активність максимальна на 15-й і 20-й дні. Отже, in vitro активація макрофагів БЦЖ призводить до транзиторної експресії протипухлинної активності і тривалої стійкої рістстимулюючих активності.

З урахуванням цих даних стає зрозумілим характер взаємодії БЦЖ-активованих макрофагів і пухлинних клітин в процесі тривалого ко-культивування in vitro: в перші дні за рахунок цитотоксичності значно знижується кількість життєздатних клітин, одночасно цитостатичні фактори гальмують їх проліферацію, але потім завдяки виділеним ростовим факторів інтенсивність проліферації вижили пухлинних клітин значно вища, ніж у резидентних макрофагів, в результаті чого їх загальна кількість досягає і навіть перевищує вихідний рівень.

У ряді випадків при культивуванні малих доз пухлинних клітин - до 10 на лунку (т. Е. В співвідношенні ефектор / мішень 5000: 1) - цитотоксичної активності може бути досить для елімінації всієї пухлинної популяції, проте в тих випадках, коли ростовая фракція перевищить певний поріг цитотоксичної активності, спостерігається інтенсивне зростання пухлинних клітин. Саме це пояснює відсутність достовірності результатів культивування малих доз клітин, так як відхилення від середньої величини відрізнялися більшою амплітудою.

Таким чином, здатність макрофагів, активованих БЦЖ, контролювати ріст пухлинних клітин in vitro обмежена і виявляється тільки в співвідношеннях ефектор / мішень, вельми далеких від реально можливого in vivo, - 500: 1 - 5000: 1. При цьому протипухлинна активність транзиторна, а опухольстімулірующая носить більш тривалий і стійкий характер. Тому була зроблена спроба потенціювати протипухлинну активність БЦЖ-активованих макрофагів шляхом впливу на них циклофосфамидом. За даними літератури, цей протипухлинний препарат є цілком "сумісним" з БЦЖ-агентом (т. Е. Стимулює БЦЖ-індуковану цитотоксичність) і, отже, може бути компонентом комбінованої хіміоіммунотерапіі на основі застосування БЦЖ.

Циклофосфамід вводили мишам внутрішньоочеревинно в дозі 200 мг / кг, за 9 днів до того отримали також внутрибрюшинно 1 мг БЦЖ. На наступний день перитонеальні клітини виділяли і оцінювали їх цитотоксичну активність, здатність підтримувати зростання пухлинних клітин в субоптимальних концентраціях і впливати на зростання автономно зростаючої пухлинної популяції в умовах ко-культивування. Виявилося, що циклофосфамід самостійно індукував істотну цитолітичну і цітостатіче-ську активності, крім того, достовірно посилював БЦЖ-індуковану цитотоксичність .. При цьому в присутності макрофагів, активованих комбінацією БЦЖ з циклофосфамідом, рівень проліферації пухлинних клітин в залежних від ростових факторів концентраціях (102 клітин на лунку) був 2,9 "104 ± 3,25-103 і значно перевищував такий при культивуванні пухлинних клітин на БЦЖ-активованих макрофагах - 3,7-103 ± 1,4-102, практично не відрізняючись від їх зростання в присутності нестимульований макрофагів - 3,2-104 ± 4,82-103.

Таким чином, незважаючи на досить високий рівень цитотоксичності макрофагів, індукований їх обробкою слідом за БЦЖ ще і циклофосфамідом, такі макрофаги втрачали здатність навіть до обмеженого контролю ко-куль-тівіруемой з ними популяції пухлинних клітин.

З урахуванням досить значною в цій серії експериментів втрати клітин під впливом факторів цитотоксичності (в окремих дослідах цитолитическая активність досягала 70%) і приросту клітин, який можна порівняти з таким після ко-культивування на резидентних макрофагах, можна вважати, що спільне застосування БЦЖ і циклофосфаміду надає аддитивное дію на продукцію ростових факторів макрофагами.

Таким чином, наявні в літературі дані про сумісність БЦЖ і циклофосфаміду, будучи абсолютно справедливими по відношенню до протипухлинної активності активованих макрофагів, не відображають можливого кінцевого результату такого суміщення, явно небажаного з клінічної точки зору. Слід зазначити, що характер відповіді макрофагів на активацію МБО in vivo має схожість з таким in vitro. Як показано ще в перших роботах по застосуванню БЦЖ, імунотерапія цим препаратом ефективна тільки протягом короткого терміну, а потім відбувається стимуляція пухлинного процесу, причому протипухлинну активність макрофагів, досить швидко згасаюче як in vitro, так і in vivo, як правило, не вдається відновити повторними введеннями препарату, її викликав, і в разі успіху така реактивація короткочасна.

Дані літератури досить однозначно вказують на відсутність кореляції між цитотоксичною активністю БЦЖ-активованих макрофагів in vitro і їх впливом на пухлинні клітини in.vivo. Якщо виходити з представлених нами даних, це стає цілком зрозумілим: знищення in vitro навіть більшості пухлинних клітин при подальшому стимулюванні зростання залишилися призводить до явного нівелювання ефекту цитолітичного дії, особливо якщо врахувати його відносну короткочасність в порівнянні з рістстимулюючих дією. Крім того, виявляється in vitro цито-статистична активність залежить від таких факторів, як аргіназа, виснаження культурального середовища через підвищений метаболізму активованих макрофагів, продукція токсичних радикалів, атомарного кисню та ін. В умовах in vivo ці ефекти можуть не проявлятися в зв'язку з припливом аргініну , інших поживних речовин до клітин, наявністю антагоністів радикалів і т. д.

Як відомо, при пухлинному процесі макрофаги сприяють розвитку пухлини на "органному" рівні шляхом поліпшення мікрооточення (мається на увазі стимуляція ангіогенезу, формування строми пухлини, елімінація продуктів розпаду пухлинних клітин). Віднайдені макрофагами імуносупресивні фактори, зокрема простагландин Е2,здатні інактивувати інші імунологічні механізми різі-стентності до пухлинного росту. Такі фактори, як інтерлейкін-1 (ІЛ-1), фактор некрозу пухлини (ФНП), що виділяються активованими макрофагами, здатні пригнічувати проліферацію більшої частини відомих ліній пухлинних клітин, однак вони є і стимуляторами росту деяких з них.

З огляду на високий ступінь гетерогенності пухлинної популяції і посилення росту такої під впливом продуктів активованих макрофагів, не можна виключити появи стійких і навіть залежних від ФНП та ІЛ-2 клонів. І якщо у відносно нетривалих до часу терміни взаємодії макрофагів і пухлинних клітин в умовах експериментальних моделей такі ефекти не виявляться, то в реальних умовах ймовірністю такого відбору нехтувати не можна. Це особливо актуально, якщо враховувати, що макрофаги практично неминуче залучаються до реалізації будь-якого иммунотерапевтических впливу, тому продемонстровані тут негативні наслідки їх активації можуть позначитися і на ефективності всієї програми імунотерапії, спрямованої спочатку на інші ефектори імунної системи.

Таким чином, продукція макрофагами факторів, що стимулюють ріст пухлинних клітин, є дуже суттєвим компонентом відповіді цих клітин на МБО. Відповідно при оцінці і відборі потенційних МБО необхідно оцінювати не тільки їх здатність до індукції протипухлинних реакцій, а й можливість експресії побічної рістстимулюючих активності. Тільки поглиблене вивчення цього питання., Спрямованого на виявлення чинників, що стимулюють ріст пухлинних клітин, шляхів їх біосинтезу в макрофагах і їх регуляцію, може лягти в основу розробки методів селективного придушення небажаних в онкологічній ситуації рістстимулюючих властивостей активованих МБО макрофагів при одночасній збереження і активації їх протипухлинної активності.

Перитонеального макрофагів ЯК МОДЕЛЬ ДЛЯ ВИВЧЕННЯ атерогенних ПОТЕНЦІАЛУ СИРОВАТКИ КРОВІ

Накопичення ліпідів у клітинах гладеньких м'язів (ГМК) і макрофагах інтими аорти є характерною рисою атеросклерозу людини і експериментальних тварин. Було показано, що сироватки крові хворих ішемічною хворобоюсерця (ІХС) з ангіографії-но підтвердженим коронарним атеросклерозом на відміну від сироваток крові здорових осіб мають здатність викликати накопичення ліпідів в культивованих клітинах інтими аорти людини. Це властивість було названо атерогенное, оскільки накопичення ліпідів супроводжувалося іншими атеросклеротичними проявами на клітинному рівні - посиленням проліферативної активності та синтезу позаклітинного матриксу. Однак зв'язок між атерогенних і атеросклерозом остаточно не з'ясована.

Дослідження з цієї проблеми засновані на первинному культивуванні субендотеліальних клітин інтими аорти людини. Складність роботи обумовлена необхідністю постійного забезпечення стерильним аутопсійного матеріалом, а також високою вартістю виділення і культивування клітин.

Раніше було показано, що здатність акумулювати внутрішньоклітинно холестерин при культивуванні з атерогенной сироваткою володіють ГМК аорти людини і мононуклеарние клітини периферичної крові. Ці дані дозволяють вважати, що для визначення атеро-генності сироватки крові можуть бути використані не тільки субендотеліальні клітини інтими аорти.

Метою роботи було визначення можливості використання легкодоступних перитонеальних макрофагів для визначення атерогенності сироватки крові.

Кров для досліджень б взята у хворих на ІХС, підтвердженої при коронарної ангіографії, і здорових донорів. ГМК були виділені з аорти чоловіків, взятої в асептичних умовах через 24 годин після раптової смерті, ступила від інфаркту міокарда. Людські перитонеальні макрофаги були виділені з асцитичної рідини хворих недостатністю кровообігу. Мишачі перитонеальні МФ отримані від нестимульований мишей.

Вплив сироватки крові здорових донорів і хворих на ІХС на рівень холестерину в клітинах

інтими аорти

медії аорти

мишачі макрофаги

людські макрофаги

У таблиці наведено зміст загального холестерину в ГМК інтими і медії аорти людини, в перитонеальних мишачих і людських макрофагах, інкубованих 24 год в присутності 20% сироваток крові здорових донорів і хворих на ІХС. Видно, що інкубація клітин в 20% сироватці крові здорових донорів не призводить до статистично значущого підвищення рівня холестерину в клітинах, а інкубація в 20% сироватці крові хворих на ІХС викликає достовірне підвищення вмісту внутрішньоклітинного холестерину як в ГМК, так і в перитонеальних макрофагах. Таким чином, так само, як ГМК інтими і медії аорти, перитонеальні макрофаги мишей і людини можуть бути використані для оцінки атерогенності потенціалу сироватки крові. Крім того, накопичення холестерину в макрофагах відбувається в 1,5-2,5 рази швидше, ніж в ГМК. Обидва ці факти, а також більш легкий спосіб отримання культури макрофагів дозволяють вважати, що ці клітини можуть бути використані для оцінки атерогенності потенціалу сироватки крові значно частіше, ніж ГМК.

При культивуванні мишачих, людських макрофагів і ГМК з 10 атерогенними і 10 неатерогеннимі сироватками крові встановлена прямий кореляційний зв'язок між акумуляцією холестерину в макрофагах і в ГМК інтими аорти. Крім того, акумуляція холестерину в людських і мишачих макрофагах знаходиться в прямій залежності від концентрації сироватки (рис 1) і часу культивування (рис 1А). При культивуванні макрофагів з сироваткою здорових осіб такого ефекту не виявлено.

Під час інкубації людських і мишачих макрофагів з сироватками крові хворих на ІХС виявлено підвищення вмісту в клітині вільного холестерину і тригліцеридів в 1,5- 2 рази, ефірів холестерину в 2,5-3 рази. При цьому. рівень фосфоліпідів не змінювався.

У групі здорових донорів тільки у 22 (28%) з 80 осіб сироватки крові викликали акумуляцію холестерину в культурі клітин. У групі хворих на ІХС у 83% осіб сироватки крові викликали достовірне підвищення рівня загального холестерину в макрофагах, т. Е. Мали атерогенними властивостями.

Не виявлено кореляції між атерогенних крові хворих на ІХС та вмістом в сироватці загального холестерину, тригліцеридів, а по-А1, а по-В і ХС ЛПВЩ.

Отримані дані свідчать про наявність прямої кореляції між акумуляцією ліпідів в ГМК і макрофагах, а також про те, що здатність виявляти атерогенность сироватки крові. При використанні перитонеальних макрофагів не відрізняється від даних, отриманих раніше при використанні ГМК інтими аорти. Під час культивування перитонеальні макрофаги акумулюють вільний і естеріфіцірованний холестерин, тригліцериди, т. Е. Ті ж ліпіди, які при інкубації включають в себе ГМК інтими аорти. Використання ГМК утруднено через складнощі отримання асептичного матеріалу в достатній для роботи обсязі. Людські і особливо мишачі макрофаги позбавлені цих недоліків. Ці факти доводять, що культура перитонеальних макрофагів разом з культурою ГМК інтими аорти може бути використана як тест-система для оцінки атерогенності потенціалу сироватки крові.

Макрофаги, можливо, є одним з головних клітинних акцепторів ліпідів в судинній стінці. Давно вже було показано наявність макрофагів, насичених ліпідами, в атеросклеротичних бляшках. Експериментальні роботи, в яких використовувалася культура клітин, виявили здатність макрофагів інтенсивно накопичувати ефіри холестерину при інкубації з хімічно модифікованими ліпопротеїдами.

Використання культури макрофагів дозволить продовжити вивчення природи атерогенності сироватки крові хворих на ІХС та її ролі в патогенезі атеросклерозу.

ВПЛИВ ГАМК, ГОМК І глутамінової КИСЛОТИ НА ФУНКЦІОНАЛЬНУ активність фагоцитів

За останні роки проводиться інтенсивне вивчення ролі нейроактивних амінокислот в імунологічних процесах. Це пов'язано з широким використанням даних амінокислот в неврологічній і психіатричній практиці, однак одночасно з їх прямими ефектами отримані дані про їх вплив на імунологічні процеси. Отримано дані про вплив гамма-аміномасляної (ГАМК), гамма-оксимасляної (ГОМК) і глутамінової кислот на кількість антітелообразующіх, розеткообразующіх клітин і інші показники імунітету. Досліди проводилися в двох серіях: в I серії на інтактних мишах вивчався вплив нейроактивних амінокислот на функціональний стан МФ і нейтрофілів. У II серії вплив тих же речовин на стан фагоцитів вивчалося на тлі попередньої імунізації тварин. Імунізацію проводили 5% суспензією еритроцитів барана в кількості 1 млна 3-й день після введення препарату. Контрольну групу становили інтактні миші, що одержували фізіологічний розчин (контроль I), і тварини, получавшіефізіологіческій розчин і імунізовані еритроцити барана (контроль II).

Введення інтактним тваринам (I серія) нейроактивних амінокислот супроводжувалося суттєвими зрушеннями активності кислої фосфатази в МФ і нейтрофільних лейкоцитах. Необхідно відзначити, що зміна активності в вивчених групах носило різноспрямований характер. Так, в умовах введення ГАМК активність ферменту в МФ і лейкоцитах крові підвищувалася в порівнянні з контрольною групою в 1,7 рази, при введенні ж ГОМК відбувалося достовірне зниження активності кислої фосфатази лише в МФ. Показники активності ферменту при введенні інтактним мишам глутамінової кислоти не відрізнялися від таких контрольної групи.

Вивчення впливу біологічно активних речовин на тлі попередньої імунізації еритроцитами барана у всіх дослідних групах II серії виявило значне зниження активності кислої фосфотаза в нейтрофільних лейкоцитах. Щодо низькі показники активності в досліджуваних клітинах крові були зареєстровані при введенні ГОМК і глутамінової кислоти, які були нижче відповідно в 2 і 1,4 рази контрольного рівня. Активність досліджуваного ферменту в МФ досвідчених груп II серії не відрізнялася від такої в контролі, за винятком групи, в якій на тлі імунізації вводили ГОМК, де вміст кислої фосфатази знижувався майже в 2 рази.

У серії проведених цитологічних досліджень було встановлено, що нейроактівние амінокислоти в піддослідних дозах не викликають у клітинах фагоцитарного ряду дистрофічних і деструктивних змін. Так, ні в одній досліджуваній групі I серії не було виявлено ознак розпаду, фрагментації і лізису цітоплазміческой і ядерної мембран, пікнозу ірексіса ядер. У той же час в групах, де вводили ГАМК і ГОМК, ядра моноцитів виглядали гіпертрофованими і гіпохромними, цитоплазма-помірно вакуолизированной. Не виключено, що нейроактівние амінокислоти в біологічно допустимих дозах не чинять цитотоксичної впливу на моноцити і нейтрофільні лейкоцити в крові інтактних мишей. Однак суттєві зрушення в активності основного маркера лізосом-кислої фосфатази наводять на думку, що досліджувані біологічно активні речовини, не надаючи безпосереднього токсичної дії на клітинну мембрану, викликають все-таки дестабілізацію внутрішньоклітинних мембранних структур, і, в першу чергу, лізосомальних. Беручи до уваги ту обставину, що активність лізосомальних ферментів багато в чому залежить від функціонального стану мембран, а точніше-від ступеня її проникності, була проведена спеціальна серія експериментів з вивчення проникності лізосомальних мембран за допомогою прижиттєвого флюорохромірованія фагоцитів акридиновим помаранчевим (АТ). Результати досліджень із застосуванням АТ показали, що зміна тинкторіальних властивостей клітин-мішеней спостерігалося при введенні в організм мишей всіх досліджуваних нейроактівіих амінокислот. При введенні ГАМК, ГОМК і глутамінової кислоти період напіврозпаду (Т 1/2) помітно скорочується, а при експозиції Т "/ а, протягом якого відбувається поетапне зміна тінкторнальних властивостей складових компонентів клітин (цитоплазма, ядро, ділянки локалізації лізосом), кількість фагоцитів із зеленою флуоресценцією ядер в дослідних групах I серії достовірно знижувалося. Аналогічна спрямованість чітко простежувалася в усіх дослідних групах II серії.

Резюмуючи вищевикладене, можна зробити висновок, що нейроактівние амінокислоти істотно впливають на активність кислої фосфатази в фагоцитах. Особливо слід відзначити, що отриманий ефект в групах введення ГАМК і ГОМК був діаметрально протилежним: цей факт простежується найбільш чітко в тих випадках, коли в якості об'єкта вивчення активності кислої фосфатази виступали МФ. Введення ж ГАМК та глутамінової кислоти на тлі попередньої імунізації не позначалося на активності кислої фосфатази в МФ, в той час як в нейтрофільних лейкоцитах всі досліджувані нейроактівние амінокислоти викликали достовірне зниження активності ферменту.

Експерименти з застосуванням в якості індикатора проникності лізосомальних мембран АТ показали, що нейроактнвние амінокислоти, не володіючи цітодеструктівним дією па клітини-мішені, викликають дестабілізацію лізосомальних мембран, спрямовану в бік збільшення їх проникності. Зіставлення показників проникності лізосомальних мембран тварин I і II серій показує, що для підвищення проникності під впливом нейроактивних амінокислот формування гуморального імунітету є умовою необов'язковим.

Таким чином, нейроактівние амінокислоти надають виборче вплив на морфофункціональний стан лізосомальних апарату фагоцитів. Це підтверджується отриманими даними про проникності лізосомальних мембран щодо токсичного барвника і кількісного визначення активності основного маркера лізосом - кислої фосфотаза.

IV. висновок

Наведена лише мала частина експериментів з моделювання різних впливів, говорить на користь того, що процеси порушень або зміни фагоцитуючої активності дуже зручно вивчати шляхом постановки дослідів на перитонеальних МФ. Можна сказати, що дана модель давно стала базовою для перевірки різноманітних хімічних і фармакологічних препаратівв якості агентів, що впливають на клітинну ланку імунітету; для вивчення процесів взаємодії інфекційних агентів з фагоцитами. Також вона використовується для вивчення не тільки фагоцитарної функції - але і навпаки, різних процесів, пов'язаних з самими інфекційними агентами. Можна згадати, що проводяться дослідження по вивченню фагоцитів перитонеального ексудату у генетично діабетичних мишей, у генетично імунодепресивних щурів і т.д.

Звичайно ті дані, які отримують дослідники досить відносні, адже незважаючи на високу якість проведених дослідів, вони все ж проводяться in vitro,що незмінно накладає свій відбиток - клітини тут позбавлені тієї гами цитокінових впливів, яка присутня в живому організмі, вони не взаємодіють з стромальних компонентами і іншими клітинами. Перевагою методу є його простота, доступність і, що важливо, наочність, а також висока швидкість отримання результатів і широкі можливості по постановці "реєстраційних" реакцій. Однак, як видно, цим в сучасній патології ми не можемо обмежитися. Тому в сучасних наукових і клінічних дослідженнях застосовують і інші методи і моделі. Про деякі з них коротко буде розказано нижче.

ДЕЯКІ ІНШІ МОДЕЛІ ВИВЧЕННЯ фагоцитозу.

Одна з найбільш реалістичних моделей фагоцитозу - це модель in vivo.Дана модель дозволяє отримувати достовірну інформацію і моделювати процеси з урахуванням впливу внутрішнього середовища. Однак вона складніша в реалізації і часом не дає можливості працювати з організмом людини. Модель in vivoіснує в двох варіантах

Модель на фагоцитах сироватки крові. Звичайно, в цьому випадку об'єктом нашої уваги будуть не МФ, а моноцити крові і нейтрофільні лейкоцити. Модель дозволяє вивчати вплив на стан фагоцитів і фагоцитарної функції загальних, системних процесів, таких як гіпоксія, гіпобарія, радіація і ін. Також шляхом внутрішньосудинного введення різних речовин можна отримати даних про їхній вплив. Вивчається вплив і внутрішніх системних активних речовин: гістаміну, простагландинів
Модель фагоцитозу у вогнищі хронічного запалення. Одна з найбільш "клінічних" моделей. Тут об'єктом уваги є як тканинні МФ, так і епітеліоїдних клітини, гігантські багатоядерні клітини, клітини чужорідних тілі ін. Велика увага приділяється явищу незавершеного фагоцитозу, процесам придушення міграції, зниження кисень-залежної цитотоксичності.

Дуже оригінальна модель була розроблена в лабораторії імунології Інституту акушерства і гінекології ім. Отта РАМН (автори: О.А.Павлов, С.А.Сельков, А.В.Селютін, Е.Е.Андреева і ін.). Вони вивчали роль плацентарних МФ в проблемах родової діяльності і, особливо - в проблемі невиношування вагітності. Макрофагів фетоплацсптарного комплексу (МФК), на думку дослідників, до недавнього часу приділялося невиправдано мало уваги. Лише в останні роки з'явилася низка публікацій, присвячених цим клітинам. Багато функцій МФК тільки належить з'ясувати, проте вже зараз стає очевидним, що серед популяцій різних клітин, які складають тканину плаценти, МФК є найбільш ймовірними кандидатами на роль регуляторного (а, можливо, і ключового) ланки в ряді репродуктивних процесів. З точки зору патогенезу розвитку родової діяльності при передчасних і термінових пологах МФК представляють особливий інтерес в силу особливостей ряду властивостей і положення цих клітин.

Плацентарні макрофаги (клітини Кащенко-Гофбауера) належать до системи мононуклеарпих фагоцитів, що мають спільне походження зі звичайними МФ. Ці клітини в значній кількості містяться в тканини плаценти і складають переважну більшість її імунокомпетентних клітин. За даними деяких авторів, макрофаги складають до 40% популяції нетрофобластних клітин ворсин хоріона.

Традиційно вважалося, що прерогативою мононуклеарних фагоцитів в фетоплацентарного комплексу є видалення клітинного детриту, захист від мікроорганізмів, участь в системі захисту плода від місцевого материнського імунної відповіді. Вони також беруть участь в реалізації і модуляції імунної відповіді і представляють першу лінію захисту проти інфекції, забезпечуючи неспецифічні імунні реакції і продукуючи регуляторні сигнали для специфічних. Таким чином, унікальність положення МФК полягає в тому, що, з одного боку, вони, як ефекторні клітини, вступають в безпосередній контакт з інфекційними агентами та іншими продуктами, що проникають в організм господаря (в даному випадку в єдину систему "мати-плацента-плід "), а, з іншого боку, будучи активованими в результаті цього контакту, здатні продукувати безліч розчинних сигнальних молекул, що впливають на функції прилеглих клітин.

У число цих факторів входять і цитокіни, зміст яких змінюється з початком спонтанної пологової діяльності - ФНОа, ІЛ-1, ІЛ-6 та ІЛ-8. Передбачається, що ці цитокіни, які продукують макрофагами, стимулюють синтез ПГ і тим самим ініціюють скоротливу активність матки. Більш того, показано, що макрофаги можуть самостійно продукувати ПГЕ2 ПГ2а, які безпосередньо впливають на міометрій. Макрофаги також здатні до секреції трансформуючого ростового фактора-β (ТРФ-β), який грає важливу роль в ембріональному морфогенезі і впливає на функції клітин трофобласта і ендометрія. Нещодавно в експериментах in vitroотримані переконливі докази участі клітин плаценти в процесі пологів. Автори продемонстрували пов'язане з родовою діяльністю збільшення секреції ФНП-α макрофагами, взятих у жінок в результаті спонтанних пологів або індукованих пологів шляхом штучно розродження, а також ІЛ-1 і ІЛ-6 ендотеліальними клітинами плаценти. Всі ці дані свідчать про внесок клітин плаценти, в тому числі макрофагів, в підвищення рівня цитокінів в межах фетоплацентарного комплексу при спонтанної пологової діяльності. Припущення про можливу роль ПМ в передчасному і термінове пологах змушують поглянути на цю клітинну популяцію як на найважливіший елемент, який впливає на гестаційні процеси. У зв'язку з цим активація ПМ може розглядатися як подія, що веде до передчасних або терміновим пологів. Встановлено позитивну кореляцію між підвищенням рівня деяких цитокінів (туморнекротізірующій фактор-α, інтерлейкін-1 і -6), які секретуються в тому числі активованими макрофагами, і настанням передчасних і термінових пологів. Спробували виявити зв'язок між наявністю родової діяльності на різних термінах вагітності і ступенем активації ПМ in vitro, проякою судили за рівнем експресії антигенів МНС II і фагоцитарної активності клітин, опосередкованої Fс- і СЗ-рецепторами. при наявності родової діяльності. Збільшувалася кількість клітин, що експресують МНС II і СКЗ і володіють здатністю до фагоцитозу. На більш пізніх термінах вагітності не вдалося виявити достовірного збільшення активності ПМ при родової діяльності. Згідно з даними зниження рівня фагоцитозу відбувалося за рахунок зниження активності окремої клітини, в той час як кількість фагоцитів суттєво не змінювалося. Для того, щоб з'ясувати, чи відображає спостерігається тенденція існуючу закономірність, або є наслідком неоднорідності досліджуваного матеріалу, необхідно досліджувати додаткову кількість плацент.

Отримані результати свідчать про перспективність застосування збагачених культур ПМ для вивчення ряду аспектів імунології репродукції, зокрема для з'ясування клітинних механізмів, що лежать в основі нормальних і передчасних пологів.

Література.

Д.І. Маянский, Клітка Купфера і система мононуклеарних фагоцитів, Москва, 1983
Методи вивчення in vitro клітинного імунітету, під ред. Блума і Глейд, Москва, 1974
И.И.Мечников, Лекції з порівняльної патології запалення, Москва, 1947
Терапевтичний архів, 1990, Т62, N11
Питання медичної хімії, 1988, Т34, Вип.1
Лабораторна справа, 1984, N5
Лабораторна справа, 1985, N1
Лабораторна справа, 1992, N2
Лабораторна справа, 1989, N4
Імунологія, 1983, N1
Імунологія, 1983, N2
Імунологія, 1987, N6
Імунологія, 1989, N4
Імунологія, 1999, N1
Бюлетень експериментальної біології і медицини, 1988, N1
Бюлетень експериментальної біології і медицини, 1989, N11
Бюлетень експериментальної біології і медицини, 1990, N1
Бюлетень експериментальної біології і медицини, 2000., Т129, N6
Бюлетень експериментальної біології і медицини, 1999, Т127, N4
Журнал мікробіології епідеміології та іммунобіологіі 1990, N5
Архів патології, 1994, Т56, N1
Медична імунологія, 2001., Т3, N3
експериментальна та клінічна медицина, 1989, Т29, N3
Експериментальна і клінічна медицина, 1989, Т29, N6
Цитологія, 1992, Т34, N7

бібліографічна посилання

Запалення і макрофаги

Ітаконат і інтерферони типу I (ІФН I)

Загальна інформація

функціонал

Детальніше про завдання

Які ж бувають види макрофагів?

висновок

Популярне